高效液相色譜法測定阿侖膦酸鈉維生素D3片中維生素D3的含量及有關物質

周 華

（杭州民生藥業有限公司，浙江 杭州310011）

阿侖膦酸鈉維生素D3片用于防治和治療各種骨質疏松癥，如絕經后婦女的骨質疏松癥、男性骨質疏松癥。維生素D3可以提高肌體對鈣的吸收，使血漿鈣的水平達到飽和程度，促進生長和骨骼鈣化，從而輔助阿侖膦酸鈉治療骨質疏松癥。由于維生素D3對光、熱不穩定，在空氣中氧化和光解成前、反式維生素D3和速甾醇D3等多種產物，故我們選取制成包合物的維生素D3干粉為原料，再與其他藥物制成復方制劑，以提高穩定性。由于制劑中維生素D3含量極低，且以包合物形式存在，故測定難度大。本文采用正相高效液相色譜法，可在同一色譜系統下測定制劑中維生素D3含量及其有關物質。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2487－1525－717液相色 譜 儀；Waters510－996 液相色譜儀；色譜柱：Aglient硅膠柱（ZORBAX RX－SIL，4.6mm×250mm，5μm）；島津2550型紫外可見分光光度計；超聲波發生器。

1.2 試藥

阿侖膦酸鈉維生素D3片（自制，每片含5 600IU，即0.14mg維生素D3，批號：20100830）；維D3干粉（10 000IU／g，DSM Nutritional Products Ltd.／瑞士，UT08120065）；維D3對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100061－200607）；對照樣品（FOSAMAX Plus D，批號：Y3335）。異丙醇、異辛烷、正己烷、二甲基亞砜均為色譜純，丁羥甲苯、正戊醇為分析純，水為注射用水。

2 方法與結果

2.1 測定法

2.1.1 對照品貯備溶液的制備

精密稱取維生素D3對照品25mg，置100mL棕色量瓶中，加異辛烷80mL，避免加熱，用超聲處理助溶1min使完全溶解，加異辛烷至刻度，搖勻，作為貯備溶液①；精密量取5.0mL至50mL棕色量瓶中，加異辛烷稀釋至刻度，搖勻，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作為貯備溶液②。

2.1.2 色譜條件與系統適用性試驗

用硅膠為填充劑，正己烷－正戊醇（997∶3）為流動相，檢測波長為264nm。量取維生素D3對照品貯備溶液①5mL，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加熱1h，取出迅速冷卻，加正己烷5mL，搖勻，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波長分別為254nm和365nm的紫外光燈下，將石英吸收池斜放成45°，并距燈管5～6cm，照射5 min，使溶液中含有前維生素D3、反式維生素D3、維生素D3和速甾醇D3；取此溶液200μL注入液相色譜儀，測定維生素D3的峰值，先后進樣5次，相對標準偏差應不大于2.0%；前維生素D3（與維生素D3的比保留時間約為0.5）與反式維生素D3（與維生素D3的比保留時間約為0.6）以及維生素D3與速甾醇D3（與維生素D3的比保留時間約為1.1）的峰分離度均應大于1.0。

2.1.3 響應因子測定

精密量取對照品貯備溶液②5mL，置50mL量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻，作為對照品溶液；取200μL注入液相色譜儀，計算維生素D3的響應因子f1。f1＝C1／A1。式中：C1為維生素D3對照品溶液的濃度（μg／mL），A1為對照品溶液所得色譜圖中維生素D3峰的峰面積。另精密量取對照品貯備溶液5mL置50mL量瓶中，加入2，6－二叔丁基對甲酚（BHT）結晶1粒，通氮排除空氣后，密塞，置90℃水浴中加熱1.5h，取出迅速冷卻至室溫，加正己烷至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液；取200μL注入液相色譜儀，計算前維生素D3的響應因子f2。f2＝（C2－f1A1）／A2，式中C2為f2測定項下維生素D3對照品溶液的濃度（μg／mL），f1為維生素D3的校正因子，A1為混合對照品溶液所得色譜圖中維生素D3的峰值，A2為混合對照品溶液所得色譜圖中前維生素D3的峰值。

取該制劑項下制備的供試品溶液進行測定，按下列公式計算維生素D3及前維生素D3折算成維生素D3后的總濃度 （Ci）。Ci＝f1Ai1＋f2Ai2，式中Ai1為維生素D3的峰值，Ai2為前維生素D3的峰值。

2.2 樣品含量測定供試品溶液制備

避光操作。取阿侖膦酸鈉維生素D3片粉約一片量（約含5 600單位VD3，0.14mg），精密稱定，置于100mL棕色容量瓶中，加稀釋劑（DMSO－水10∶2，0.02%BHT）50mL，超聲10min（水浴溫度不超過30℃），使維生素D3溶解，精密加入提取液（0.02%BHT的正己烷溶液）20mL，振搖15min，離心5min（5 000rpm），取上層清液作為供試品溶液。照含量測定法測定。

2.3 樣品有關物質測定溶液制備

避光操作。取阿侖膦酸鈉維生素D3片粉適量（約含32 000單位VD3，0.8mg）精密稱定，置于100mL棕色容量瓶中，加稀釋劑（DMSO－水10∶2，0.02%BHT）50mL，超聲10min（水浴溫度不超過30℃），使維生素D3溶解，精密加入提取液（0.02%BHT的正己烷溶液）20mL，振搖15min，離心5min（5 000rpm），取上層清液作為供試品溶液。取供試品溶液1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取供試品溶液和對照溶液各200μL，照測定法檢測。

2.4 專屬性試驗

分別取維生素D3對照品、維生素D3干粉、空白輔料、阿侖膦酸鈉維生素D3片粉，分別經過光照、高溫、酸、堿、氧化破壞后，按照有關物質測定的方法處理并進樣。同時分別取а－生育酚及干粉的其他輔料以及空白溶劑（DMSO－水10：2，0.02%BHT）50mL，按照有關物質測定的方法處理并進樣。結果：保留時間4min以前的為溶劑峰及空白輔料峰，不干擾含量及有關物質的測定，可以扣除。維生素D3的降解產物與主峰完全分離，不干擾含量及有關物質的測定。檢測出的最大雜質證明為輔料中引入的а－生育酚，含量遠低于其產生生理活性的量，且與其他雜質峰完全分離，可用相對保留時間定位扣除。

2.5 線性及范圍

分別精密量取對照品儲備液適量，用正己烷稀釋成維生素D3濃度為3.5、4.9、6.3、7、7.7、9.1、10.5μg／mL 的溶液，各溶液分別置自動進樣器中自動進樣（n＝3），記錄維生素D3峰面積。峰面積均值X對進樣濃度Y（μg／mL）線性回歸，得回歸方程為：A＝322354C＋5597.5，r＝0.9997。

2.6 回收率試驗

取維生素D3干粉39、56、76mg（約相當于VD3為98、140、190μg）各3份，分別置于100mL棕色量瓶中，各加入1片量的空白輔料，加稀釋劑（DMSO－水10∶2，0.02%BHT）50mL，超聲10min（水浴溫度不超過30℃），使維生素D3溶解，精密加入提取液（0.02%BHT的正己烷溶液）20mL，振搖15min，離心5min（5 000rpm），取上層清液作為供試品溶液。取供試品溶液，照測定法測定，即得。平均回收率為98.72%，RSD為1.10%（n＝9）。

2.8 儀器精密度

取一樣品溶液置自動進樣器中，連續進樣5次，日內RSD為0.47%。

2.9 溶液穩定性

取一樣品溶液置自動進樣器中，分別于0、3、6.5、9.5、12.5、15.5、20h進樣，RSD為1.70%。

2.10 樣品含量測定及重復性試驗

對同一樣品（20100830）連續測定6次，求得含量為100.76%，RSD為1.20%。

2.11 樣品有關物質測定

批號FOSAMAX Plus D Y3335，最大單雜為0.35%，雜質總量0.90；自制20100830，最大單雜為0.29%，雜質總量1.10。

3 討論

維生素D3的正己烷溶液的紫外掃描圖中的最大吸收峰為264nm，且主要雜質的最大吸收也在264nm附近，故選擇264nm為含量測定和有關物質測定的檢測波長。由于維生素D3干粉在生產過程中，外層包裹了明膠等水溶性的物質，本文采用的稀釋劑（DMSO－水10∶2，0.02%BHT），能溶解包合材料及維生素D3，再用正己烷提取濃縮出來，以達到測定濃度的要求。而其他文獻中采用皂化后提取測定的方法，操作不但繁瑣，而且在皂化及提取中有部分損失，因而影響結果。本文的方法無須皂化，從而減少了處理過程中維生素D3的損耗，提高了測定的準確度，回收率高，輔料無干擾，同時具有簡便、快捷的特點。本文樣品溶液制備方法的摸索過程中，針對稀釋劑中DMSO和水的比例、超聲時間、提取液的體積、BHT的用量、振搖時間、離心時間及速度，均做了比較性試驗，確定了最終的制備方法，提取回收率及方法回收率均較高。有關物質測定方法專屬性較強，自制樣品與進口對照樣品測定結果接近。

［1］彭清濤，譚生建，崔瑞芳，等.高效液相色譜法測定鈣維康膠囊中維生素D3的含量［J］.藥物分析雜志，1998，18（6）：231.

［2］胡曉文，裴元英，陸國椿.維生素D3微囊的制備及含量測定［J］.中國藥房，2008，19（1）：25.

［3］張學農，周慧，苗愛東，等.正相高效液相測法定碳酸鈣顆粒劑中微量維生素D3含量［J］.新疆醫科大學學報，2002，25（1）：47.

［4］藍錦富，劉麗仙.鈣加維生素D膠丸中維生素D3的含量測定［J］.中國醫院藥學雜志，2006，26（4）：145.

［5］仲宣惟，夏瑞，施捷.HPLC法測定保健品中維生素D2、D3的含量［J］.藥物分析雜志，2007，27（11）：86.

［6］王海鳳，王東凱，趙鵬，等.HPLC檢測注射用復方維生素中的多種成分［J］.藥物分析雜志，2006，26（12）：146.