RNAi研究肝癌侵襲轉移相關基因進展

胡 衛，王 泉，方肇勤

（1.三峽大學 醫學院，湖北 宜昌 443002；2上海中醫藥大學 基礎醫學院，上海 201203）

肝癌是我國最為常見的惡性腫瘤之一，我國的肝癌患者約占全球總患者數的55%，其相關死亡率排名第二，僅次于肺癌［1］。迄今為止針對肝癌的治療缺乏行之有效的方法，應用最多的手術切除肝癌，其5年的復發轉移率十分高，死亡率也居高不下［2］。肝癌的復發和轉移有一系列基因參與調控，它涉及到細胞基因改變、侵襲力、黏附能力、產生局部血凝因子或血管生成的能力、分泌代謝功能以及腫瘤細胞與宿主、腫瘤細胞與間質之間相互關系的多步驟、多因素參與的過程［3］。RNA 干擾（RNAi）是由雙鏈 RNA（double－stranded RNA，dsRNA）引起的廣泛存在于動植物中的序列特異性轉錄后基因沉默，從而抑制其相應基因表達的過程。近年RNAi已被認為是真核生物基因表達的主要調節機制，由于其具有高效性、高特異性和高穩定性等特點，已成為基因功能研究的有力工具，廣泛應用于闡述包括腫瘤在內的各種疾病的分子機制，為可能的基因治療和藥物治療提供依據。近年來在肝癌研究中，通過RNA干擾技術抑制相關基因表達后，再檢測細胞侵襲、遷移能力或者實驗動物腫瘤的轉移情況，揭示了肝癌發生發展、轉移復發的分子機理。

1 肝癌轉移復發的分子機制

肝癌轉移復發涉及細胞粘附、運動、增殖、細胞外基質的降解、機體免疫與腫瘤血管生成等環節，其分子機制主要有：與侵襲相關的抑癌基因的失活和癌基因的表達增加、與轉移和復發有關的細胞因子及其受體表達水平的變化、基質金屬蛋白酶異常表達、腫瘤微血管密度的影響等。

2 肝癌轉移復發相關基因的RNAi

現在已經發現了一大批與肝癌轉移相關的基因，如H－ras基因、Bmi－1基因、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因、p53基因等。

2.1 H－ras基因

H－ras基因定位于11p15.5，由于它編碼的蛋白質分子量為21kb，又被稱為p21分子。在原發性肝癌中，H－ras癌基因mRNA及蛋白質水平均有明顯升高。Wang等［4］應用磷酸鈣轉染法將H－ras基因導入人肝癌細胞株SMMC－7721，發現轉染H－ras的細胞粘附能力提高、運動能力增強及cⅣase、EGFR表達增加，且上述變化與p21的表達顯著相關，表明H－ras癌基因能在體外誘導人肝癌細胞的轉移表型的產生，提高肝癌細胞的轉移潛能。由于突變的H－ras基因與正常的H－ras基因堿基序列不同，利用RNAi的特異性可對突變的H－ras基因進行針對性抑制。有學者將H1啟動子嵌入到MSCV病毒載體中組成siRNA載體，成功地抑制了ras基因的表達［5］。

2.2 CXCR4

趨化因子受體CXCR4（chemokine receptor4，CXCR4）是組織表達最為廣泛的趨化因子受體之一，在肝癌中的高表達與其細胞的生長、侵襲、轉移中都有很重要的作用［6］。夏斌等［7］將構建的靶向CXCR4的siRNA真核表達載體通過脂質體轉染入人肝癌細胞SMMC7721后，發現干擾組能明顯抑制肝癌細胞的生長和轉移。

2.3 Rho－C基因

Rho－C（Ras homologous C）基因是 Rho家族的一個成員，參與細胞信號的傳導、增殖和肌動蛋白細胞骨架的調節，在多種腫瘤尤其是轉移侵襲性強的腫瘤中表達增高［8］。近年來發現Rho－C與腫瘤的侵襲、轉移及轉移表型的獲得有密切關系［9］。有研究［10］用 Rho－C－siRNA 真核表達 載體轉染SK2－Hep1肝癌細胞后，細胞中Rho－C蛋白表達水平降低達60%，細胞黏附、運動能力及體外侵襲能力均降低。ZHENG等［11］用Rho－C基因的RNA干擾載體轉染肝癌細胞Bel7402，以沉默Rho－C基因表達，結果顯示Rho－C基因沉默能夠促進肝癌細胞Bel7402凋亡并抑制細胞遷移和非錨定生長能力。

2.4 OPN基因

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因定位在人類基因組的4q13，它與腫瘤及原癌基因的調控密切相關。OPN含有與細胞粘附有關的精氨酸－谷氨酸－天冬氨酸（RGD）序列，并通過受體CD44、整合素等來促進細胞的趨化、粘附和遷移。Ye等［12］報道OPN在轉移性、高侵襲性的肝癌中過表達。在試驗中敲除掉OPN特異性抗體的細胞，無論在實驗室還是植入裸鼠后，很快發生了轉移。溫敏杰等［13］的研究也證實了RNA干擾降低OPN的表達后，肝癌裸鼠移植瘤的體積和質量明顯縮小。

2.5 HMGA1

HMGA1（High mobility group A1，高遷移率族蛋白A1）是位于細胞核內的小分子非組蛋白，參與細胞多種重要生物學過程。HMGA1在胚胎期表達豐富，而在成熟組織中則表達極少或缺失。在病理情況下，相當多的惡性腫瘤組織中均發現有HMGA1的高水平表達，并且其表達量與腫瘤惡性程度及轉移能力成正相關［14，15］。朱明光等［16］成功建立了基因沉默HMGA1穩定細胞株；HMGA1基因沉默后，細胞增殖與質粒對照組和空白對照組相比顯著降低，細胞凋亡百分率明顯升高。

2.6 c－Met

原癌基因c－met編碼的跨膜蛋白c－Met是肝細胞生長因子（HGF）的單一受體。大量的證據表明，HGF／c－Met信號通路異常在人類各種腫瘤轉移中起重要作用，該通路的內源及外源抑制劑引起了人們的廣泛關注。謝斌等［17］探討了c－Met－siRNA對肝細胞癌生長和侵襲的影響，將構建好的c－Met－siRNA的逆轉錄病毒顆粒感染靶細胞 MHCC97－H后發現，目的基因的表達量顯著降低，且細胞的生長、運動及侵襲均受到明顯抑制。

2.7 CDC25B

CDC25B（cell division cycle 25B）是CDC25激酶家族的最重要成員，貫穿細胞周期的各階段，其在細胞周期各期轉換中起關鍵作用，在細胞有絲分裂過程中發揮重要作用。過量CDC25B可促進腫瘤生長和細胞惡性轉化。Xin等［18］通過實時定量PCR和免疫組化染色方法證實CDC25B在肝癌組織表達明顯高于正常肝臟組織，并將針對CDC25B基因的siRNA轉染肝癌細胞株Hep3B和Hep40后，顯著抑制CDC25B基因表達（90%），同時明顯抑制了腫瘤細胞的增殖、運動和侵襲能力，將細胞阻滯在G2期，在接種Hep40的裸鼠身上也發現其能明顯抑制腫瘤的生長。

2.8 Bmi－1

原癌基因 Bmi－1（B cell－specific moloney murine leukeria virus insertion site－1）是多梳基因家族（polycomb group genes，PcG）的成員之一，在細胞的增殖和干細胞自我更新、分化調節中發揮重要作用［19，20］。目前，已有多項研究報道Bmi－1在多種腫瘤如白血病、乳腺癌、肺癌、胃癌等中高表達，并且與腫瘤的轉移和擴散相關［21］。李小磊等［22］將針對Bmi－1基因序列特異性的Bmi－1－siRNA轉染高轉移性人肝癌細胞株MHCC97－H，發現沉默Bmi－1基因表達可抑制肝癌細胞株MHCC97－H的侵襲遷移力。

2.9 P53

野生型P53是一種抑癌基因，與細胞的轉化和肝細胞癌的發生關系密切［23］。在同時表達野生型P53和點突變P53的細胞中，RNA序列能特異地抑制突變型P53的表達，并在一定程度上恢復野生型基因P53的表達和功能［24］。有人［25］將外源性 P53dsRNA 瞬時轉染肝癌 SK－Hep－l細胞系，發現P53dsRNA可明顯抑制P53和部分抑制P21蛋白的表達，并明顯促進SK－Hep－1細胞的增殖。

2.10 ICAM－1

血清可溶性細胞間粘附分子－1（Serum Intercellular Adhesion Molecule－1，sICAM－1）屬于免疫球蛋白超家族成員，它不僅參與免疫效應細胞識別，而且在多種腫瘤細胞中過度表達，與腫瘤侵襲轉移關系密切。廖維甲等［26］成功構建了針對該基因的pGenesil－1／ICAM－1表達載體并轉染人肝癌細胞株Bel－7402和HepG2，并通過實時定量PCR和免疫組織化學方法檢測肝癌細胞中ICAM－1基因表達抑制情況。結果表明經特異性siRNA作用后肝癌細胞中ICAM－1基因的表達受到抑制，同時細胞增殖受到抑制。

2.11 Hpa

Hpa（heparanase，肝素酶）是一種β－D－葡萄糖苷酸內切酶，在腫瘤細胞浸潤、轉移和腫瘤血管形成過程中起重要作用。檀英霞等［27］將脂質體介導的方法將構建的2個Hpa－shRNA真核表達載體穩定轉染人肝癌細胞株HepG2（高表達Hpa），將干擾組和對照組的腫瘤細胞接種到裸鼠皮下，發現干擾后的HepG2細胞中Hpa mRNA和蛋白質表達明顯降低，干擾組裸鼠的腫瘤生長速度明顯變慢。

2.12 VEGF

VEGF（vascular endothelial growth factor，血管內皮生長因子）具有強大的刺激血管生成能力，可增加微血管的通透性，刺激內皮細胞分裂以及增加組織因子和一些蛋白酶的產生，在肝癌的發生、發展、轉移中起促進作用。蔣冬貴等［28］將自主構建的pcDUVEGF－1和pcDUVEGF－2以及體外合成的 TWvegf－1和 TWvegf－2siRNA片段轉染肝癌Hep－3B細胞，檢測轉染前后VEGF的 mRNA及蛋白表達水平，結果兩種RNA干擾的方法均能顯著抑制VEGF基因mRNA及蛋白質的表達。

2.13 ezrin

骨架蛋白的重排是引起細胞運動能力增加，腫瘤早期轉移的基礎。ezrin（膜－細胞骨架聯接蛋白）作為ERM蛋白家族的成員，是一種胞膜與細胞骨架的聯接蛋白。張巖等［29］先檢測ezrin和骨架蛋白在不同轉移潛能肝癌細胞系中的表達，再選取高轉移潛能SF7721和MHCC97－H細胞系為研究對象，發現RNA干擾可下調這兩個細胞系中ezrin蛋白的表達，并且使其增殖和侵襲能力均顯著下降。

3 展望

RNAi現象的發現及其分子生物學機制和功能的初步闡明，為成功地應用RNAi從基因水平研究肝癌提供了理論基礎，為肝癌的靶向治療奠定了基礎。隨著RNAi技術的迅速發展。有關肝癌發生、發展和轉移的多基因、多位點研究取得了豐碩成果，充分顯示了RNAi在肝癌研究中的巨大潛力和廣闊的應用前景。RNAi研究肝癌轉移復發相關功能，少見系統深入的研究報道，都是針對某個與腫瘤復發轉移相關基因，構建載體研究其表達下調后對肝癌侵襲轉移能力的影響，均沒有進一步研究其作用機制。此外，目前對RNAi沉默目的基因后基因功能的檢測，沒有形成一套容易操作且能明確體現目的基因的主要生物學功能標準，這也是現階段RNAi應用于腫瘤相關基因功能研究的一個重要問題；而且目前針對單基因的研究較多，而RNAi應用于系統研究多基因功能的報道較少見，而肝癌的發生是多因素、多基因共同作用的結果，開展多基因功能篩選、以細胞通路為研究對象是以后的發展趨勢。

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