促紅細胞生成素對體外帕金森病模型細胞凋亡及Bax蛋白表達的影響

盧 欣

鄭州大學基礎醫學院 鄭州 450052

目前的藥物治療能夠改善帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）患者的部分癥狀，但不能改變疾病最終結局，目前仍缺乏有效的治療藥物和預防措施。近年研究發現促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種細胞保護劑，其保護作用在多種中樞神經系統疾病模型中得到證實［1-2］。本試驗通過觀察EPO 對體外PD 模型細胞凋亡和Bax蛋白表達的影響，探討促紅細胞生成素對PD 細胞的保護作用，為臨床治療PD 提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗用SD 乳鼠（＜24h）由鄭州大學實驗動物中心購得，試劑6-OHDA、DMEM 高糖培養基和特級胎牛血清購自美國Sigma公司，兔抗鼠TH 試劑盒和Bax免疫組化試劑盒購自武漢Boster公司，TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒（比色法）購自北京中昊生物公司，EPO 購自沈陽三生制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組：將12只乳鼠用75%酒精消毒，在超凈臺內斷頭取出中腦腹側部，剔除干凈腦膜和血管，用預冷的PBS洗滌3遍，加入0.25%胰酶12mL 在37℃水浴消化20min，加入含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養液終止消化1min，2 000目濾網過濾。按2×105／mL 和1×105／mL加入6孔板和96孔板中，37℃、5%CO2孵箱中培養，隔日換液。培養至第7天加入EPO（10U），12h后加入6-OHDA（100μmol／L），分為對照組，6-OHDA 組和EPO＋6-OHDA 組。

1.2.2 TH 免疫組化鑒定多巴胺能神經元：處理后的細胞按TH 試劑盒說明操作進行，細胞膜或胞漿內出現棕黃色產物的細胞為TH 陽性細胞即多巴胺能神經元。

1.2.3 TUNEL 法 細 胞 原 位 凋 亡 檢 測：凋 亡 細 胞 采 用TUNEL法檢測，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.4 Bax免疫組化染色：用SABC 法，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.2.5 結果觀察：在顯微鏡下觀察TH 陽性細胞、TUNEL陽性細胞和Bax免疫陽性細胞的表達情況，用媒體真彩色病理圖文分析系統對圖像進行分析。

1.3 統計學方法 數據用SPSS 13.0進行統計學處理，采用t檢驗和方差分析，結果均以（±s）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TH 陽性細胞 TH 陽性細胞為棕黃色的多巴胺能神經元細胞。6-OHDA 組TH 陽性細胞明顯減少，神經元突起變短消失；EPO＋6-OHDA 組神經突起較長且較多，相互交織在一起。

2.2 TUNEL法凋亡細胞檢測 TUNEL 染色陽性的凋亡神經元呈三角形或扇形，固縮深染，體積縮小，胞核呈棕黃色，非凋亡細胞則為藍色。6-OHDA 組存在明顯的神經元細胞凋亡（P＜0.05），EPO＋6-OHDA 組神經元凋亡細胞明顯減少（P＜0.05）。見表1。

2.3 Bax蛋白表達 Bax蛋白表達部位在神經元細胞的胞質，Bax陽性神經元形狀不規則，胞內沉積有棕黃色物質。6-0HDA 組Bax蛋白表達較高（P＜0.05），EPO＋6-OHDA 組Bax蛋白表達減少（P＜0.05）。數據見表1。

表1 促紅細胞生成素對多巴胺能神經元的保護作用（±s，n＝6）

表1 促紅細胞生成素對多巴胺能神經元的保護作用（±s，n＝6）

與對照組比，＊P＜0.05；與6-OHDA 組比，△P＜0.05

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3 討論

帕金森病（Parkinson＇s disease，PD）是一種以靜止性震顫、肌肉僵直、運動弛緩和姿勢步態異常等癥狀為主要臨床表現的中樞神經退行性疾病。其主要病理特征為中腦黑質多巴胺能神經元的變性死亡。到目前為止，PD 的發病機制仍不完全清楚。研究表明6-OHDA 可在體外誘導多巴胺能神經元細胞的凋亡［3-4］。該實驗用6-OHDA 干預制作體外帕金森病模型，TH 免疫組化方法鑒定多巴胺能神經元，TUNEL法檢測PD 模型細胞凋亡和測定Bax表達。

促紅細胞生成素（EPO）是一種有效的神經細胞保護劑，在多種神經系統的疾病模型中已經得到證實［1］。EPO 受體在一定條件下能夠在多巴胺能神經細胞表面表達，說明EPO對其可能有保護作用［5］。在MPTP 誘導的PD 模型中，EPO可以使神經元凋亡率下降［6］。Tatton等和Adams等的研究證實PD 患者黑質神經元Bax表達增強，細胞凋亡增加［7-8］。Kumral等的研究證實EPO 可以降低促凋亡蛋白Bax的表達［9］保護神經元細胞。其可能的機制是減少線粒體內活性氧的產生，導致細胞色素C 產生減少，使Caspase活性減弱，從而抑制了細胞凋亡［10-11］。Yan等［12］實驗也表明EPO 對PC12細胞的PD 模型有明顯的保護作用，Bax蛋白表達減少凋亡細胞減少。本實驗在制作PD 模型前預先加入EPO 保護，測定凋亡細胞和Bax蛋白，發現與對照組比較，6-OHDA組細胞凋亡有顯著性差別（P＜0.05），同時Bax蛋白表達明顯增高（P＜0.05）。而預先加入EPO 后情況明顯不同，EPO＋6-OHDA 組與6-OHDA 組比較，凋亡細胞數目和Bax蛋白表達均明顯減少（P＜0.05），說明EPO 對PD 的神經元細胞有保護作用，使Bax蛋白表達下降細胞凋亡減少。

EPO 能一定程度上抑制細胞凋亡減少Bax蛋白表達，從而保護多巴胺能神經元細胞，因此EPO 可以作為神經保護劑，為臨床治療和預防PD 提供新的理論依據。

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