一氧化氮合酶堿基多態性與缺血性腦血管病的關系

孟秀君 胥麗霞 林 巧 田 野 任玉峰 侯 華

(中國醫科大學附屬第四醫院神經內科，遼寧 沈陽 110005)

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是嚴重威脅人類健康的常見病、多發病，其致病因素包括環境因素和遺傳因素兩大方面。遺傳因素在ICVD發病過程中起著很重要的作用，家系及雙生子研究表明ICVD具有遺傳易感性〔1，2〕，腦卒中個體有特異性遺傳構成傾向〔3〕。近些年來越來越多的研究發現一氧化氮合酶基因位點上第7外顯子上G298A、啟動子-786T＞C和第4內含子上4 b/a堿基多態性與ICVD有關。本試驗探討該基因位點上此三個基因位點與ICVD的關系。

1 材料與方法

1.1 對象 隨機選取2011年3月至2011年6月就診于我院的老年ICVD患者共138例為病例組，包括大動脈粥樣硬化性腦梗死56例和小動脈閉塞性腦梗死(腔隙性腦梗死)82例，其分型依據中國肝素藥物治療急性缺血性腦卒中試驗(OAST)分型〔4〕，診斷標準參照1995年中華神經科學會第四屆全國腦血管病學術會議修訂的各類腦血管疾病診斷要點。所有病例均經影像學檢查(頭CT或MRI)證實。排除標準:瓣膜性心臟病、房顫、近期心肌梗死、血液病、腫瘤、癲癇、自身免疫性疾病及由炎癥、栓子、腦血管畸形或動脈瘤等引起的繼發性腦卒中。病例組合并腦梗死68例(49.3%)，合并高血壓98例(71.0%)，合并糖尿病29例(21.0%)，合并冠心病35例(25.4%)。對照組來自研究期間在我院進行體檢的健康老年人群，有心、腦血管病或糖尿病病史者均予以排除，按年齡相差＜5歲，性別、民族相同與病例進行匹配，共100例。

所有研究對象均為漢族，彼此間無血緣關系。在本人知情同意情況下，對所有研究對象進行調查問卷來獲取人口學特征和已知的危險因素，包括種族、年齡、性別、疾病史、吸煙、飲酒等。病例組與對照組研究對象的一般臨床資料見表1。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集 受檢者空腹12～15 h，于次日晨8時采外周靜脈血10 ml分裝3個管，2個管加入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)進行血常規測定(2 ml)和生化測定(4 ml)，1管用于DNA提取(4 ml)。血生化檢測指標包括肝功能、腎功能、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等。所有檢測均采用國際通用方法和標準試劑，在我院檢驗科完成。血液樣本在4℃條件下保存。

1.2.2 DNA的提取 采用快速氯仿異戊醇法提取DNA(采用天根DP318-03公司提供的微量DNA提取試劑盒)，提取的DNA樣品分裝后放于-20℃保存。

1.2.3 引物 eNOS基因位點G298A的引物:正向:5'-CAT GAG GCT CAG CCC CAG AAC-3';反向:5'-AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA C-3'。-786T＞C的引物:正向:5'-CAC CCA GGC CCA CCC CAA CT-3';反向:5'-GCC GCA GGT CGA CAG AGA GAC T-3'。4 b/a的引物:正向:5'-CTA TGG TAG TGC CTT GGC TGG AGG-3';反向:5'-ACC GCC CAG GGA ACT CCG CT-3'。

1.2.4 PCR-RFLP法檢測基因型 20 μl PCR體系中，含有0.1 μg基因組 DNA 模板，2 mmol/L MgCl2，0.2 μmol/L 引物，200 μmol/LdNTP，以及0.5 U Taq酶。2×Taq PCR Master Mix購買自寶生物D512A。E298D和4b/a的PCR條件為:95℃ 3 min，之后按下述條件進行 35個循環(94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃45 s)，最后72℃ 10 min。取上述PCR產物5 μl在瓊脂糖凝膠中電泳，10 μl PCR 產物中加 1 μl 10 × buffer和 0.5 μl Mbo I，37℃處理過夜，電泳檢測;G等位基因為206 bp的條帶，T等位基因為119 bp和87 bp的條帶，而4b和4a等位基因分別為210 bp、183 bp。-786T＞C PCR條件為:95℃ 3 min，之后按下述條件進行 35 個循環(94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 35 s)，最后72℃ 10 min;取5 μl PCR 產物電泳檢測，10 μl PCR 產物加1 μl 10 ×buffer和0.5 μl Mbo I，37℃處理過夜，電泳檢測;T等位基因片段長度為415 bp，而C等位基因為370 bp和45 bp兩個片段。

1.3 統計學方法 應用SAS統計軟件對所有數據進行分析，臨床參數用s表示，計量資料和計數資料分別用t檢驗和χ2檢驗。基因型頻率和等位基因頻率差異采用χ2檢驗，采用Logistic回歸平衡協變量〔吸煙、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、TC及LDL、空腹血糖(FPG)〕計算OR值及其95%可信區間(CI)。

2 結果

2.1 兩組的一般臨床特征 兩組進行了年齡和性別的匹配，有差異的危險因素有吸煙、SBP、DBP、TC及LDL。見表1。病例組同型半胱氨酸水平為(22.0±20.8)μmol/L。

2.2 內皮型氧化氮合酶 (eNOS)基因型在病例組和對照組的分布 eNOS上G298A，4b/a和786C在病例組和對照組之間均無統計學差異 (P＞0.05)，提示eNOS基因型在ICVD患者與健康人群中的分布無差異。將兩組之間有差異的變量包括:吸煙、SBP、DBP、TC、LDL行多元非條件Logistic回歸分析，結果顯示兩組之間仍然沒有顯著性差異 (P＞0.05)。見表2。

表1 兩組一般臨床資料比較(s)

表1 兩組一般臨床資料比較(s)

67.6±10.9 66.0±10.6 0.06 0.92 0.63～1.08男性〔n(%)〕 99(71.7)64(64.0)0.20 0.70 0.40～1.22吸煙〔n(%)〕 69(51.1)20(20.0)＜0.01 4.18 2.31～7.58飲酒〔n(%)〕 29(21.0)21(21.0)0.99 1.00 0.53～1.88 SBP(mmHg)149.2±20.9 121.2±14.4 ＜0.01 0.14 0.01～0.62 DBP(mmHg)86.6±11.3 67.3±8.5 0.02 0.35 0.25～0.74 TC(mmol/L)8.1±39.7 5.3±1.0 0.05 0.73 0.59～0.84 TG(mmol/L)1.6±1.4 1.5±1.1 0.57 0.79 0.68～1.40 HDL(mmol/L)1.1±0.3 1.3±0.2 0.75 0.78 0.60～1.70 LDL(mmol/L)3.0±1.0 2.3±1.0 0.04 0.44 0.34～0.68 FPG(mmol/L)%CI年齡(歲)因素 病例組(n=138)對照組(n=100)P值 OR值 95 6.0±1.5 5.8±1.6 0.37 0.83 0.58～1.35

2.3 eNOS等位基因在病例組和對照組的分布 三種等位基因在ICVD患者和健康人群之間的分布有明顯差異。見表3。

表2 病例組和對照組eNOS基因型分布〔n(%)〕

表3 eNOS等位基因在病例組和對照組的分布〔n(%)〕

3 討論

內皮一氧化氮(nitric oxide，NO)的作用有:維持血管內的血液流動、血管的舒張、自動調節、保持血管壁的完整性、抑制血管平滑肌細胞增生、抑制血小板聚集及血細胞黏附、趨化〔5，6〕。NO合酶(NOS)共有3種類型:內皮型、神經型及誘導型。eNOS存在于血管內皮細胞內，在正常機體內由此酶催化合成內皮NO，從而發揮促進血管舒張、抑制平滑肌細胞增生及血小板聚集等作用。eNOS催化L-精氨酸生成瓜氨酸和NO，因此，eNOS是NO合成的關鍵酶。eNOS基因位于人類第7條常染色體上，是一條長21 k、包含26個外顯子的基因片段。人eNOS含有1 203個氨基酸，其基因為單拷貝，定位于染色體7q352q36，全長21～22 kb，包括26個外顯子和25個內含子。第7外顯子G894T突變使編碼的第298位谷氨酸(Glu，等位基因G)被天門冬氨酸(Asp，等位基因T)所取代，使eNOS構象改變，從而使eNOS酶活性下降，NO生成減少〔7〕。第4內含子處27個堿基(GAATGTCTAGACCTGATGCAGGGGGTGAG)4次或5次串聯重復，此處多數人的等位基因是5個重復序列(4b)，少數人為4個重復序列(4a)。正常人的基因型為4b，一些研究提示4a會增加腦卒中的患病風險〔8〕，而啟動子-786位點上T-C等位基因的突變同樣也導致NO生成減少。

盡管NO與內皮細胞的功能密切相關，但關于G298T與ICVD關系各研究結論各不相同。Elbaz等〔7〕對法國的研究提示eNOS Glu298AspT等位基因純合子與腦梗死，尤其腔隙性梗死有關，并認為該基因遺傳易感性與LDL存在協同作用;Saidi等〔8〕對北非突尼斯國ICVD的研究同樣發現Glu298Asp等位基因在ICVD患者中具有較高的頻率;Cheng〔9〕對我國人群的研究也發現了該基因與ICVD存在微小的聯系，然而關于土耳其人〔10〕和高加索人〔11〕的研究卻沒有發現 Glu298Asp與 ICVD 之間的關聯。本研究也發現，Glu298Asp與ICVD無明顯相關，Glu298Asp的各基因型分布在病例組與對照組之間無明顯差異。上述對不同人群的研究結論截然相反，可能為研究人群種族不同可能會影響研究結果。

關于4b/a與ICVD的關系，國內外的研究結論大相徑庭，Tao等〔12〕的一項Meta分析發現4b/a等位基因在ICVD和健康人群中無差別，我國的一項研究發現4bb是腦血管病的保護基因〔13〕，Majumdar〔14〕雖然認為4b/a在15 ～45 歲 ICVD 患者與非ICVD患者之間無明顯差異，但也提示4a是提示女性ICVD患者的危險因素。本研究同樣提示4b/a在ICVD與健康人群中無差異性分布。這些不同、甚至相互矛盾的結論的可能原因在于除了樣本大小不一之外，性別差異也是其影響因素之一。其具體的機制可能是:性激素可以通過eNOS發揮收縮血管和舒張血管的雙重作用，eNOS可以催化內皮NO的生成，同時也能催化誘導性NO的合成，而后者不利于腦血流的調節及側支循環的開放，甚至會加劇腦細胞損傷〔15〕，而這種變化是隨著內環境的變化而變化的。

近些年來，啟動子上-786T到C堿基的突變與ICVD的關系也是研究的熱點之一。-786T到C堿基的突變會導致NO的合成下降〔16〕。Howard等〔17〕的研究發現，攜帶 -786TT 的黑人女性患缺血性腦卒中的概率是無此基因女性的3倍，而在白人女性中則沒有發現這種聯系。Munshi〔18〕對南印第安人的研究則發現4b/a與ICVD的發生存在明顯相關，與健康人群比較腦卒中患者中4a等位基因頻率較高。在中國人中也存在著這樣的聯系。Moe等〔19〕在新加坡人群中的研究也提出初次ICVD與NOS無明顯關系，這與本研究結果一致。從上述的研究結論中可以推測，eNOS基因多態性不僅與種族相關，在不同性別人群中也可能存在差別，同時樣本種類的選擇也可能會影響到研究的結論。

本研究提示，吸煙、SBP、TC及LDL在病例組與對照組間存在明顯的差異，這也預示作為腦血管病的危險因素，傳統的環境因素在ICVD的病因中也許占據了更大的成份。

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