三種方法檢測Aβ所致PAJU細(xì)胞凋亡

丁斌蓉 涂秋云 楊 霞 白 松 劉 肖 唐湘祁 (中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院老年科，湖南 長沙 4003)

研究表明Aβ神經(jīng)毒性涉及介導(dǎo)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元內(nèi)鈣超載、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、改變突觸功能等多個方面〔1～5〕。其中，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是Aβ神經(jīng)毒性的一個重要環(huán)節(jié)。腦卒中和腦缺血后阿爾茨海默病(AD)的發(fā)生率顯著增加，缺氧是AD的病因之一〔6〕。故觀察缺氧條件下Aβ作用所致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的情況對探討AD的損傷機制和評估各種防治因素的效果具有重要意義，選擇一種合適的檢測細(xì)胞凋亡的方法對觀察效果起著決定性的作用。為選擇一種理想的檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡的方法，我們對MTT法、Hoechst 33258細(xì)胞核染色法、流式細(xì)胞檢測這幾種常用的觀察細(xì)胞凋亡的方法進(jìn)行了觀察。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(PAJU細(xì)胞由芬蘭赫爾辛基大學(xué)生命科學(xué)院 Carl G.Gahmberg教授惠贈);Aβ42(rPeptide公司);MTT、Hoechst 33258(Sigma公司);DMEM powders(Gibco公司);胰蛋白酶粉(Amoresco公司);低溫高速冷凍離心機(Eppendorf)，酶標(biāo)儀 (SUNRISE，TECAN，Switch);流式細(xì)胞計數(shù)儀(FACScan，BECTON DICKINSON，USA);熒光顯微鏡 (BX60，OLYMPUS，Japan);Microtek ScanMaker 5600 掃描儀。

1.2 方法

1.2.1 Aβ42的“老化”處理〔7，8〕以儲存濃度為231 μmol/L 置于37℃的PBS中孵育7 d左右即為“老化”狀態(tài)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) PAJU細(xì)胞以5×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃，培養(yǎng)穩(wěn)定后，分組:①常態(tài)組:常態(tài) PAJU細(xì)胞50 ml/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96 h;②Aβ干預(yù)組:將PAJU細(xì)胞予以濃度為1.0 nmol/L老化的Aβ42干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)96 h;③缺氧組:將PAJU細(xì)胞置于缺氧環(huán)境(1% ～2%O2、5%CO2、93%N2培養(yǎng)箱)培養(yǎng)96 h;④Aβ干預(yù)+缺氧組:將PAJU細(xì)胞予以濃度為1.0 nmol/L老化的Aβ42干預(yù)，并置于缺氧環(huán)境中培養(yǎng)96 h。收取細(xì)胞樣品，分別用MTT法、Hoechst 33258細(xì)胞核染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.3 MTT法觀察細(xì)胞 取對數(shù)生長期的上述各組PAJU細(xì)胞，于干預(yù)前1 d以5×104/孔接種于無菌的96孔板。置37℃、飽和濕度、5%CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后再根據(jù)各組細(xì)胞的實驗要求進(jìn)一步按上述方法處理和培養(yǎng)至96 h，棄去培養(yǎng)基，加入5 g/L MTT 20 μl后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后加入150 μl DMSO，酶標(biāo)儀測定各孔A490 nm吸光度值。計算細(xì)胞存活率。

1.2.4 Hoechst 33258細(xì)胞核染色 取對數(shù)生長期的PAJU細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞密度至1×104/ml，接種于無菌24孔板中，每孔1 ml。置37℃、飽和濕度、5%CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再根據(jù)各組細(xì)胞的實驗要求進(jìn)一步按上述方法處理和培養(yǎng)至96 h，并分別于24、48及96 h將四組細(xì)胞取出，4%多聚甲醛固定20 min，1 mg/ml的 Hoechst 33258避光染色10 min后封片、避光，熒光顯微鏡下觀察。觀察后照相并計數(shù)500個細(xì)胞核，計算凋亡核百分率。

1.2.5 細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞檢測 取對數(shù)生長期的PAJU細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/ml，接種于無菌6孔板中，每孔3 ml。置37℃、飽和濕度、5%CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再根據(jù)各組細(xì)胞的實驗要求進(jìn)一步按上述方法處理和培養(yǎng)至96 h，并分別于24、48及96 h將四組細(xì)胞取出，75%乙醇固定細(xì)胞，4℃保存。上機前加入PI，孵育10 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)均以s表示，用析因分析法進(jìn)行統(tǒng)計分析，流式細(xì)胞學(xué)檢測中圖像分析系統(tǒng)所采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst 33258細(xì)胞核染色 見圖1。Hoechst 33258將細(xì)胞核染為紫藍(lán)色。正常細(xì)胞核呈均勻彌散熒光，凋亡細(xì)胞核呈濃染塊狀或顆粒狀熒光。對照組的PAJU細(xì)胞24、48和96 h后，細(xì)胞中核濃染、邊集及碎裂比例較少，經(jīng)缺氧、Aβ42處理、缺氧+Aβ42共同處理24、48和96 h后，細(xì)胞中核濃染、邊集及碎裂比例較多。各組凋亡核百分率見表1。

圖1 Hoechst 33258細(xì)胞核染色PAJU細(xì)胞

表1 Hoechst 33258細(xì)胞核染色凋亡核百分率(s，n=3，%)

表1 Hoechst 33258細(xì)胞核染色凋亡核百分率(s，n=3，%)

24 h 48 h 96 h組別

2.2 MTT比色法顯示Aβ42、缺氧對細(xì)胞增殖的影響 對照組、缺氧組、Aβ干預(yù)組、缺氧+Aβ干預(yù)組的 PAJU細(xì)胞24、48和96 h后存活率見表2。對照組與缺氧組、對照組與Aβ42組，缺氧組或 Aβ42組與缺氧并 Aβ42處理組間差異有顯著意義(P＜0.05)。另外，對照組與缺氧并Aβ42處理組間比較具有極顯著差異(P＜0.01)。

表2 MTT比色法顯示Aβ42、缺氧對PAJU細(xì)胞增殖的影響( s，n=3，%)

表2 MTT比色法顯示Aβ42、缺氧對PAJU細(xì)胞增殖的影響( s，n=3，%)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與缺氧組、Aβ42組比較:3)P ＜0.05，下表同

0.98±0.11 0.94±0.15 0.92±0.23缺氧組 0.82±0.171) 0.67±0.241) 0.63±0.141)Aβ42組 0.78±0.131) 0.57±0.211) 0.37±0.141)Aβ42并缺氧組 0.65±0.112)3) 0.51±0.112)3) 0.31±0.102)3)24 h 48 h 96 h對照組組別

2.3 流式細(xì)胞儀檢測缺氧、Aβ42所致PAJU細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞(亞G1期細(xì)胞)百分率，結(jié)果顯示PAJU對照組、缺氧處理組、Aβ42處理組、缺氧并Aβ42處理組24、48及96 h后，細(xì)胞凋亡率依次分別為(2.11%，3.79%，5.32%;8.23%，17.45%，24.21%;9.89%，19.15%，25.33%;14.12%，23.25%，45.10%)，組間兩兩比較，對照組與缺氧組、Aβ組比較，其凋亡率有顯著增加(P＜0.05);對照組與缺氧并Aβ42處理組比較，其凋亡率有極顯著增加(P＜0.01);缺氧組與Aβ組比較，其凋亡率無顯著變化(P＞0.05)。

3 討論

MTT比色法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法，其特點是靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡便，無放射性污染，與其他檢測細(xì)胞活力的方法有良好的相關(guān)性〔9〕。本實驗在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上用MTT比色法檢測發(fā)現(xiàn)缺氧、Aβ42、Aβ42同時予以缺氧處理能不同程度地影響PAJU細(xì)胞的能量代謝，干擾PAJU細(xì)胞的增殖和存活，實驗細(xì)胞存活率下降呈時間依賴性。

Hoechst 33258染色液可直接用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色，也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色。本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧、Aβ42對神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用之一是破壞細(xì)胞核;此外，還發(fā)現(xiàn)，在Aβ42同時予以缺氧處理的PAJU細(xì)胞，細(xì)胞核損壞更為嚴(yán)重，其凋亡率明顯上升，說明缺氧環(huán)境可以加重Aβ42的神經(jīng)毒性作用，這種效應(yīng)呈時間依賴性。

流式細(xì)胞術(shù)是一種生物學(xué)技術(shù)，用于對懸浮于流體中的微小顆粒進(jìn)行計數(shù)和分選。這種技術(shù)可以用來對流過光學(xué)或電子檢測器的一個個細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)的多種參數(shù)分析。流式細(xì)胞術(shù)可以檢測的參數(shù)有:細(xì)胞的體積和形態(tài)復(fù)雜程度DNA(細(xì)胞周期分析、細(xì)胞動力學(xué)、細(xì)胞增殖等)，細(xì)胞存活能力、細(xì)胞凋亡等。本實驗流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，缺氧、Aβ42對PAJU細(xì)胞有抑制作用，缺氧能加重Aβ所致細(xì)胞凋亡，與文獻(xiàn)一致〔10〕。

通過比較上述MTT比色法、Hoechst 33258細(xì)胞核染色、流式細(xì)胞技術(shù)在本實驗中的應(yīng)用，我們發(fā)現(xiàn)這三者對于細(xì)胞活性的檢測結(jié)果基本一致。凋亡的檢測方法有多種，不同的樣品可以用不同的方法來檢測。上述三種檢測方法各具特點，可相互補充:MTT比色法快捷、方便，適合懸浮及貼壁生長的細(xì)胞的活性檢測;Hoechst 33258細(xì)胞核染色對于細(xì)胞核受損的檢測比較敏感，實驗所需試劑較多，步驟較MTT法復(fù)雜;流式細(xì)胞技術(shù)更適合用于懸浮生長的細(xì)胞，對于貼壁生長的細(xì)胞，如果實驗前需要刮取細(xì)胞，可能破壞細(xì)胞完整性，而影響實驗結(jié)果。

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