血管緊張素1-7對糖尿病大鼠海馬胰島素降解酶的表達及認知功能的影響

唐燕霞 肖 謙 薛艷艷 張棟珉 (重慶醫科大學附屬第一醫院老年科內分泌組，重慶 40006)

胰島素降解酶(IDE)作為降解β-淀粉樣蛋白(Aβ)的重要酶，是決定生物體體內Aβ含量的關鍵因素之一，Aβ在腦內的沉積可通過神經毒性作用和誘導神經元凋亡等機制損傷認知功能〔1〕。研究報道，血管緊張素1-7〔Ang-(1-7)〕對學習記憶等認知功能有重要影響〔2〕，但Ang-(1-7)對IDE的表達有無影響，目前還未見報道。本研究以糖尿病大鼠模型作為研究對象，用Ang-(1-7)及其受體拮抗劑A-779進行干預，初步觀察Ang(1-7)對糖尿病大鼠海馬IDE的表達水平及認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 STZ(Sigma公司);Morris水迷宮及水迷宮記錄分析系統(中國醫科科學院藥物研究所研制);大鼠腦立體定位儀(Stoeling公司);Ang-(1-7)(Sigma公司);Mas受體拮抗劑A-779(Phoenix公司);RT-PCR試劑盒，DNA Marker DL2000(TaKaRa公司);羊抗大鼠IDE多克隆抗體(Santa公司);引物合成:南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及建模 SPF級SD雄性大鼠40只，9～10周齡，體重180～200 g，購自重慶醫科大學動物實驗中心(SCXK渝2007-0001)。動物適應喂養1 w后，隨機原則分為:對照組(C組)、糖尿病組(DM組)，糖尿病+Ang-(1-7)組〔DM+Ang-(1-7)組〕及糖尿病+Ang-(1-7)+A-779組〔DM+Ang-(1-7)+A-779組〕，每組各10只。建立STZ糖尿病模型，大鼠禁食12 h后，糖尿病組按60 mg/kg劑量一次性腹腔注射1%STZ，正常組注射等量生理鹽水。血糖穩定3 d后，尾靜脈隨機血糖≥16.7 mmol/L視為建模成功標準。成模后第11周，各組均進行Morris水迷宮測試，之后行側腦室注射，持續1 w，所有實驗大鼠再次進行水迷宮測試。實驗終末，糖尿病+Ang-(1-7)組死亡1只，糖尿病+Ang-(1-7)+A-779組大鼠死亡2只。

1.2.2 Morris水迷宮測試 糖尿病大鼠成模后第11周，行Morris水迷宮測試，記錄大鼠尋找平臺的時間，即逃避潛伏期，評價學習能力和觀察120 s內大鼠穿越平臺位置的次數，評價記憶能力，經水迷宮圖像自動采集和處理系統對各參數進行分析。Ang-(1-7)及A-779干預1 w后重復上述實驗。

1.2.3 側腦室注射 糖尿病大鼠建模成功后第11周，水迷宮測試完畢即行Ang-(1-7)及A-779干預。大鼠腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀下，沿顱頂正中線剪開皮膚，剝離骨膜，暴露顱骨。大鼠側腦室穿刺定位:前囟后1.0 mm，右1.5 mm，深3.5 mm，微型電鉆沿此穿刺鉆孔，將帶內芯的不銹鋼套管(外徑0.9 mm，內徑0.5 mm)垂直插入側腦室內，固定套管，縫合傷口，術后大鼠均給予青霉素抗炎。導管置入后第4天行側腦室注射。①對照組和糖尿病組注射等量生理鹽水;②糖尿病 +Ang-(1-7)組:微量注射器3 min內將 Ang-(1-7)(5 nmol，1 μl)緩慢勻速注入側腦室，留針約1 min;③糖尿病+Ang-(1-7)+A-779組:微量注射器 3 min內將 Ang-(1-7)(5 nmol，1 μl)和 A-779(50 nmol，1 μl)緩慢勻速注入側腦室，留針約1 min;各組每天給藥1次，持續7 d。

1.2.4 RT-PCR行為學測試后，大鼠斷頭，冰臺上快速取出海馬組織，液氮凍存，按照RNA提取試劑說明書提取海馬組織的總 RNA。逆轉錄體系為 20 μl，反應條件:42℃ 10 min，30℃20 min，90℃ 5 min，冰浴5 min。PCR擴增:IDE上游引物序列:5'-CGGGGCCAGGAAAGCAGTCTC-3'，下 游 引 物 序 列:5'-GCGATGCTCTGCTGGTTCAC-3'，擴增長度405 bp;GAPDH上游引物序列:5'-ACCCATCACCATCTTCCAGGAG-3'，下游引物序列:5'-GAAGGGGCGGAGATGATGAC-3'，擴增長度 159 bp。反應體系:RT 產物 2.0 μl，上下游引物各1 μl，2 × Tap PCR master mix 10 μl，補充 DEPC 水至 20 μl。反應條件:94℃ 5 min;94℃30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環;72℃ 10 min。取以上 PCR產物5 μl行瓊脂糖凝膠電泳，利用圖像分析系統對DNA條帶進行激光度掃描，凝膠分析軟件進行灰度分析，最后以目的基因與內參的灰度比值來表示目的基因mRNA表達的相對含量。

1.2.5 Western印跡 稱取-80℃冰箱保存的海馬組織塊100 mg，加入0.2 ml RIPA和2 μl PMSF，超生細胞破碎儀低溫勻漿，離心后BCA法定量蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白質轉膜，免疫印跡，ECL顯影后條帶經凝膠成像軟件分析，以 IDE與GAPDH條帶灰度比值表示IDE蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 Morris水迷宮測試結果 與對照組比較，DM組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P＜0.05)，穿越平臺次數明顯減少(P＜0.05)。與DM組比較，DM+Ang-(1-7)組逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05)，穿越平臺次數明顯增加(P＜0.05)。與DM+Ang-(1-7)組比較，DM+Ang-(1-7)+A-779組逃避潛伏期明顯延長(P＜0.05)，穿越平臺次數明顯減少(P＜0.05)。見表1。

2.2 RT-PCR結果 與對照組比較，DM組大鼠海馬IDE mRNA的表達水平明顯下降(P＜0.05);與DM組比較，DM+Ang-(1-7)組IDE mRNA的表達水平明顯升高(P＜0.05)。與DM+Ang-(1-7)組比較，DM+Ang-(1-7)+A-779組 IDE mRNA的表達水平明顯減少(P＜0.05)。見圖1，表2。

2.3 Western印跡結果 與對照組比較，DM組大鼠海馬IDE蛋白表達水平明顯下降(P＜0.05);與DM組比較，DM+Ang-(1-7)組IDE蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)。與 DM+Ang-(1-7)組比較，DM+Ang-(1-7)+A-779組IDE蛋白表達水平明顯下降(P＜0.05)。見圖2，表2。

圖1 RT-PCR檢測各組大鼠海馬IDE mRNA表達

圖2 Western印跡檢測各組大鼠海馬IDE蛋白表達

表1 各組大鼠Morris水迷宮測試結果(s)

表1 各組大鼠Morris水迷宮測試結果(s)

與正常組比較:1)P＜0.05;與DM組比較:2)P＜0.05;與DM+Ang-(1-7)組比較:3)P ＜0.05，下表同

組別 n 穿越平臺次數 逃避潛伏期(s)10 6.10±2.38 28.34±8.06 DM組 10 3.10±1.791) 54.43±9.771)DM+Ang-(1-7)組 9 5.89±1.452) 31.24±7.572)DM+Ang-(1-7)+A-779組 8 3.00±2.203) 55.93±7.943)對照組

表2 各組大鼠海馬IDE mRNA及蛋白表達水平(s)

表2 各組大鼠海馬IDE mRNA及蛋白表達水平(s)

IDE/GAPDH 10 0.65±0.09 0.56±0.08 DM組 10 0.40±0.081) 0.32±0.071)DM+Ang-(1-7)組 9 0.62±0.112) 0.52±0.102)DM+Ang-(1-7)+A-779組 8 0.38±0.063) 0.31±0.083)蛋白對照組組別 n IDE/GAPDH mRNA

3 討論

近年來的研究顯示，大腦腎素-血管緊張素系統(RAS)參與了學習記憶等認知功能的調節〔3～5〕，如:AngⅡ可以抑制海馬LTP效應、抑制大腦神經遞質乙酰膽堿的釋放、激活氧化應激以及減少中樞血流;AngⅣ可以促進膽堿乙酰轉移酶的表達增多、易化海馬LTP效應。Ang-(1-7)作為RAS中最重要的血管緊張素肽段，主要由ACE2分解AngⅡ而來，Ang-(1-7)及其功能性受體Mas在大鼠海馬、下丘腦和齒狀回顆粒細胞等都有豐富的表達〔6〕。Ang-(1-7)與Mas受體結合能夠舒張腦血管改善中樞血流、易化海馬LTP效應、調節類膽堿突觸，表明其在學習記憶等認知功能方面具有重要作用〔2，7〕。糖尿病大鼠認知功能的受損程度與Aβ的表達呈正相關〔8〕，IDE作為Aβ的高效降解酶，參與了海馬Aβ的降解。本研究結果表明，Ang-(1-7)可以通過上調海馬IDE mRNA及蛋白的表達，改善糖尿病大鼠的認知功能，推測其可能的途徑與IDE表達上調，海馬Aβ的降解增加，從而減輕Aβ的沉積有關。

1 Malaplate Armand C，Florent Bechard S.Soluble oligomers of amyloid-β peptide induce neuronal apoptosis by activating a cPLA2-dependent sphingomyelinase-ceramide pathway〔J〕.Neurobiol Dis，2006;23(1):178-89.

2 Hellner K，Walther T，Schubert M，et al.Angiotensin-(1-7)enhances LTP in the hippocampus through the G protein-coupled receptor Mas〔J〕.Mol Cell Neurosci，2005;29:427-35.

3 張棟珉，肖 謙.腎素血管緊張素系統與糖尿病腦病〔J〕.國際內分泌代謝雜志，2008;28(6):384-6.

4 張棟珉，肖 謙，李 娟.血管緊張素Ⅳ對糖尿病大鼠膽堿乙酰轉移酶表達及認知功能的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(9):1243-5.

5 Bonini JS，Bevilaqua LR，Zinn CG，et al.AngiotensinⅡdisrupts inhibitory avoidance memory retrieval〔J〕.Hormones Behav，2006;50:308-13.

6 Alenina N，Xu P，Rentzsch B，et al.Genetically altered animal models for Mas and angiotensin-(1-7)〔J〕.Exp Physiol，2007;93(5):528-37.

7 Evi Kostenis，Graeme Milligan，Arthur Christopoulos，et al.G-protein-coupled rece-ptor mas is a physiological antagonist of the angiotensinⅡtype 1 receptor〔J〕.Circulation，2005;111:1806-13.

8 蔡志友，晏 勇，張 駿.β-淀粉樣前體蛋白與β-淀粉樣蛋白在糖尿病大鼠腦組織中的表達意義及行為學相關性研究〔J〕.中國醫科大學學報，2008;37(5):644-7.