阿勒泰黃芪提取物對蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制作用

趙海清，竇 君，楊春燕，阿吉艾克拜爾·艾薩

中國科學院新疆理化技術研究所植物資源化學重點實驗室，烏魯木齊830011

隨著環境因素和行為模式的改變，糖尿病已經成為我國主要公共健康問題。2型糖尿病主要特征是胰島素抵抗。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase1B，PTP1B)是PTPase家族成員之一，被認為是胰島素和瘦素信號轉導通路的負調節因子，對2型糖尿病和肥胖癥的發生、發展有重要的負調控作用，近年來成為治療2型糖尿病等胰島素抵抗相關疾病的新靶點［1-3］。在嚙齒類動物和具有胰島素抵抗肥胖人群的脂肪及骨骼肌細胞中的蛋白表達和酶活性均處于較高水平，揭示PTP1B可能在胰島素抵抗的病理過程中具有重要的生理功能［4，5］。抑制PTP1B活性，可導致脂肪、肝臟和肌肉組織中胰島素受體和胰島素受體底物蛋白的磷酸化水平增強，提高下游通路中信號分子以及最終糖原合成，從而增強胰島素信號通路轉導，提高胰島素敏感性。因此，有效的PTP1B抑制劑可能成為一類新型的胰島素增敏劑應用于2型糖尿病和肥胖癥的治療。

黃芪屬豆科植物，藥用植物資源非常豐富，其中蒙古黃芪是常用的補氣固表中藥，臨床上廣泛應用于心、腦血管疾病以及糖尿病的輔助治療及抗腫瘤、保肝。相關的化學成分研究主要集中于蒙古黃芪、膜莢黃芪［6］，從中分離鑒定的山奈酚、槲皮素、異鼠李素、鼠李檸檬素、熊竹素等黃酮類化合及黃芪皂苷、大豆皂苷等皂苷類化合物，表現出豐富的化學多樣性。阿勒泰黃芪(Astragalus altaicus Bge)是維藥常用藥材，具有補氣固表、托瘡生肌、治體虛自汗、利尿消腫等功效，相關研究較少。程杰飛等［7］對阿爾泰黃芪的化學成分進行了研究，但沒有涉及其藥理作用。本研究應用本室所建立的PTP1B體外篩選模型，對阿勒泰黃芪提取物進行活性測定，初步證明其具有較強的PTP1B抑制活性，為進一步開發該藥用植物資源提供前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

實驗所用PTP1B為本實驗室克隆表達、提取純化。pNPP(對-硝基苯磷酸二鈉)為Sigma產品，IPTG、卡那霉素、Hepes為Merck產品，DMEM培養基、胎牛血清為Invitrogen公司產品，葡萄糖測定試劑盒為北京普利萊基因技術有限公司產品，超聲波細胞粉碎機JY92-ⅡD(寧波新芝生物科技股份有限公司)，高速冷凍離心機(Beckman，美國)，酶標儀(SpectraMax M5，美國)，其余試劑為國產分析純。CHO-K1(倉鼠卵巢細胞亞株)細胞購自中國科學院上海細胞庫。黃芪采自新疆阿勒泰地區布爾津縣，并由中國科學院新疆生態與地理研究所植物專家沈冠冕鑒定。

1.2 阿勒泰黃芪提取物制備

阿勒泰黃芪經粉碎后，用甲醇提取，再用氯仿萃取，經過大孔樹脂，用乙醇洗脫，濃縮干燥備用。

1.3 阿勒泰黃芪提取物黃酮、皂苷含量測定

參考《保健食品功效成分檢測方法》［8］，測定提取物中黃酮、皂苷含量。

1.4 蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP-1B的純化及活性測定

將含pET-30a-PTP1B1-321的大腸桿菌BL21進行培養，經0.4 mmol/LIPTG誘導3.5-4.0 h，6000 r/ min離心6 min，收集菌體，冰浴超聲破碎，4℃，12000 rpm離心10 min，取上清上Ni2+親和層析柱，充分結合，用50和100 mmol/L的咪唑洗脫，4℃過夜輕微攪拌透析，再濃縮后備用。用微量法測定所獲重組PTP1B的活性。測定反應體系:5 mmol/L pNPP，0.09 μmol/L his-PTP1B1-321，緩沖液(包括20 mmol/L HEPES，150 mmol/LNaCl和1 mmol/L EDTA(pH 7.0))，總體積為200 μL。室溫孵育 10 min，再加入pNPP，室溫孵育30 min后，用3 mol/L NaOH終止反應。在405 nm處測定吸收值，以不含酶溶液體系為空白。

1.5 提取物對PTP1B活性抑制作用的測定

1.5.1 IC50值的確定

按上述活性測定方法，提取物用DMSO溶解，按不同劑量加入，405 nm處測定吸收值，每個實驗重復 3次。按抑制率 =(OD405空白-OD405樣品)/ OD405空白×100%，求得不同濃度的抑制率。應用Origin軟件計算IC50值。

1.5.2 抑制類型的確定

調整底物濃度，測定反應的速度，取均值利用雙倒數作圖法(Lineweaver-Burk plots)確定抑制類型。

1.6 葡萄糖含量的測定

培養CHO細胞24 h后，按50 μg/mL的濃度分別添加不同的提取物，作用24 h后，收集培養液，依試劑盒操作說明測定葡萄糖含量。

1.7 數據處理

采用雙倒數作圖法確定抑制劑對酶促反應的抑制類型。在此基礎上，根據抑制類型的不同，應用不同的作圖求Ki值，即(1)非競爭性抑制，則用Dixon作圖法(以抑制劑的濃度對反應速度的倒數作圖)求Ki;(2)反競爭性抑制，Cornish-Bowden作圖法(以抑制劑濃度對反應速度的倒數作圖)求Ki;(3)混合型抑制有兩個抑制常數Ki，Ki'，所以用Dixon作圖法求Ki，同時用Cornish-Bowden作圖法求得抑制常數Ki'。

2 結果

2.1 黃芪提取物中黃酮、皂苷含量

8種提取物(E1～8)中黃酮含量分別為5.09、10.46、3.58、3.23、53.91、21.77、5.76和7.49 mg/ mL，E1、E2、E6、E7和E8皂苷含量分別為16.53、27.45、21.9、10.21和8.96 mg/mL，其余提取物中未檢測到皂苷。

2.2 黃芪提取物對PTP1B活性的影響

以pNPP為底物，NaVO3作為陽性對照，測定his-PTP1B1-321的活性。用DMSO溶解種不同的阿勒泰黃芪提取物(E1～8)，配成不同濃度，按上述方法檢測其對PTP1B抑制作用。結果顯示，E3、E4、E5和E6對PTP1B的作用不明顯;E1、E2、E7、E8對PTP1B具有較強的抑制活性，IC50分別為34.8、4.7、7.35和7.15 μg/mL。

2.3 黃芪提取物對PTP1B抑制作用的動力學分析

4種有活性提取物對his-PTP1B1-321抑制動力學進行研究。結果表明，與空白對照組相比較，阿勒泰黃芪提取物1、7和8可使表觀Km值增大，但不影響PTP1B的Vmax，雙倒數作圖后，與空白對照組的直線相交于縱軸，提示其對PTP1B的抑制作用類型屬于競爭性(圖1、圖3和圖4)。阿勒泰黃芪提取物2在雙倒數作圖時，直線的交點并不交在1/［S］軸或1/v軸上，而是相交于第II象限，表現出混合型抑制;應用Dixon作圖法，求出E2的Ki為0.177，另外，采用Cornish-Bowden作圖法求另一抑制常數Ki'為0.134，表現出Ki＞Ki'，提示其抑制作用類型為混合型中的競爭性抑制(圖2)。

圖1 阿勒泰黃芪提取物1對PTP1B抑制作用類型測定Fig.1 Determination of the inhibitory mode of extract 1 of A.altaicuson PTP1B

2.4 對葡萄糖利用的影響

在相同的濃度下，不同的提取物對CHO細胞利用葡萄糖的能力不同。提取物1、2、5、7和8較明顯提高CHO細胞對葡萄糖的利用。提取物3、4和6對CHO細胞利用葡萄糖的能力影響不明顯。

阿勒泰黃芪提取物對CHO細胞利用葡萄糖的影響Fig.5 Effect of extracts of A.altaicuson the rate of glucose in CHO cells

3 討論

由于2型糖尿病的發生與β產生胰島素、血液循環系統運送胰島素以及胰島素作用靶細胞并發揮生理作用密切相關，與之相關的酶靶，就成了2型糖尿病藥物開發的靶標［9］，同時已成為降低糖尿病發病率的重要防治策略。目前蛋白酪氨酸磷酸酶作為負性調節胰島素信號轉導的關鍵酶，對糖尿病的發生、發展有著重要的意義。PTP1B的活性和/或表達過度升高，可下調胰島素信號轉導，抑制葡萄糖的攝取和糖原合成，導致胰島素抵抗和糖尿病狀態。

從天然植物，特別是具有藥用背景的植物中分離PTP1B抑制劑是目前研究的熱點［10］。維醫藥在2型糖尿病治療方面具有較好的效果，已針對不同的靶點(如醛糖還原酶，α-葡萄糖苷酶等)，篩選出許多相關的天然抑制劑［11，12］。本研究比較維藥阿勒泰黃芪不同提取物的PTP1B抑制活性，發現4種組分對PTP1B有好的抑制作用，具有不同的抑制類型。通過細胞實驗，初步證實活性組分能有效提高細胞對葡萄糖的利用度。但是，PTP1B抑制活性的強弱與對葡萄糖利用度的影響不成正相關，提示阿勒泰黃芪除了通過PTP1B途徑降糖外，可能還存在其它的降糖方式。

黃酮類化合物的藥理活性有大量報道，已證實具有降糖、降脂、改善胰島素抵抗的作用。為此，我們研究了黃酮、皂苷的含量與PTP1B抑制活性的關系，初步推測阿勒泰黃芪中皂苷可能是主要的活性物質，將為后續的活性化合物的分離提供指導。本研究結果將為我們以活性跟蹤法從植物藥中篩選靶向性強、高效低毒的天然抑制劑提供了新的思路，并為開發為防治糖尿病及改善胰島素抵抗的藥物或保健品提供了實驗依據。

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