RP－HPLC法測定不同炮制方法中枳殼柚皮苷、新橙皮苷含量

張穎梅，李一珊，黎鈺波，林 吉，倪 晨＊

（1.廣州王老吉藥業(yè)股份有限公司，廣東 廣州510450；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510405）

枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus auranfium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實［1］，具有寬胸理氣、行氣消漲的功效，為中醫(yī)臨床常用藥之一。傳統(tǒng)枳殼炮制方法有20 多種［2］，常用的有麩炒、醋制、鹽制法等。但是，枳殼炮制品的研究多集中于麩炒枳殼上［3－4］，對其它炮制品研究報道較少，系統(tǒng)研究較少。為此，本文對枳殼原藥材及三種炮制品進(jìn)行對比研究，比較不同方法對枳殼中柚皮苷和新橙皮苷含量的影響。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀（配有SPD－M 20A230V 檢測器、CTO－20A 柱 溫 箱、DGU－20A5 泵、SIL－20A 自 動 進(jìn) 樣 器、LC－solution色譜工作站）、實驗室專用超純水機(jī)（重慶利迪現(xiàn)代水技術(shù)設(shè)備有限公司）、萬分之一電子天平（Sartorius BP110s）、高速中藥粉碎機(jī)、超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

柚皮苷（批號：110722－200309），中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)；新橙皮苷（批號：05－1010），上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心生產(chǎn)。枳殼飲片（批號：KL100628）經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室黃海波老師鑒定為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）。

2 炮制品制備

鹽制品［5］：取枳殼300g，加鹽水悶12h，干燥，即得。每100g枳殼用食鹽1g，水適量。醋制品［2］：取枳殼300g，加入定量的米醋拌勻，悶潤至醋被吸盡，置炒制容器內(nèi)，用文火加熱，炒干，取出放涼，即得。每100g 枳殼，用米醋4mL。麩炒制品：取麩皮撒在熱鍋內(nèi)，加熱至冒煙時，加入300g枳殼，迅速翻動，炒至表面色變深時，取出，篩去麩皮，放涼。每100kg枳殼片用麩皮10kg。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C185μm（250mm×4.6mm）；流動相：乙腈－水（磷酸調(diào)節(jié)pH＝3）（20∶80）等梯度洗脫；檢測波長：λ＝283nm；流速：1mL·min－1。

3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取柚皮苷對照品和新橙皮苷對照品4mg，用甲醇稀釋定容至25mL的容量瓶中，即為160μg·mL－1；從160μg·mL－1溶液中取出7.5mL 定容至10mL，即為120μg·mL－1；依此法分別配成160、120、80、60、40、20、10μg·mL－1不同濃度的混合對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

精密稱取原藥材粉末1g及炮制品粉末，炮制品粉末相對于原藥材量1g，置于錐形瓶中，加入25mL 甲醇，稱定重量，靜置1h之后超聲提取1h，用甲醇補(bǔ)足重量，搖勻過濾。放冷，取枳殼濾液2mL置25mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，0.45μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 含量測定

用液相高效色譜儀，將上述“3.3”制作的供試品溶液進(jìn)樣10μL，在波長283nm，流速1mL·min－1，流動相為乙腈－水（磷酸調(diào)節(jié)pH＝3）（20∶80）等梯度洗脫，每樣品平行兩次，計算其含量，結(jié)果見表1，液相圖譜見圖1－圖5。

圖1 枳殼混合對照品液相色譜

圖2 枳殼原藥材液相色譜

圖3 麩炒枳殼液相色譜

圖4 鹽制枳殼液相色譜

圖5 醋制枳殼液相色譜

表1 枳殼及其炮制品中柚皮苷和新橙皮苷的含量測定

3.5 線性范圍考察

分別吸取“3.2”項下160、120、80、60、40、20、10μg·mL－1不同濃度的混合對照品溶液10μL。注入高效液相色譜儀，按擬定的色譜條件分別測定峰面積，以進(jìn)樣量（μg）對峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，當(dāng)柚皮苷的進(jìn)樣量在0.1～1.6μg／mL 范圍內(nèi)時，呈良好線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y ＝1751495.2292x ＋7934.2971，R2＝0.9997；當(dāng)新橙皮苷的進(jìn)樣量在0.1～1.6μg／mL范圍內(nèi)時，呈良好線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y ＝1794005.4612x ＋3925.0300，R2＝0.9999。

3.6 精密度考察

精密吸取160μg·mL－1的混合對照品溶液10μL 連續(xù)進(jìn)樣6次，測定柚皮苷和新橙皮苷的峰面積，測得柚皮苷的平均峰面積為2775922，RSD＝0.94%；新橙皮苷的平均峰面積為2810459，RSD＝1.01%，表明儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一藥材供試液10μL，分別于0h，3h，6h，9h，12h，24h進(jìn)樣，測定柚皮苷和新橙皮苷的峰面積，測得柚皮苷的平均峰面積為1134592.5，RSD＝0.89%；新橙皮苷的平均峰面積為645753.8，RSD＝1.62%，表明供試品穩(wěn)定。

3.8 重復(fù)性考察

取枳殼飲片用去離子水浸泡后煎煮，取濾液1mL 6份，置于6個10mL容量瓶中，定容搖勻，分別用微孔濾膜過濾，每份進(jìn)樣體積5μL，測定其柚皮苷、新橙皮苷峰面積，測得柚皮苷的平均峰面積為2063931，含量平均值為1.174μg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.495%；新橙皮苷的平均峰面積為1148341，含量平均值為0.638μg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.298%。表明本方法重現(xiàn)性良好。

3.9 加樣回收試驗

按“3.3”方法制備枳殼供試品溶液，取該藥材供試品溶液6份，分別精密加入混合標(biāo)準(zhǔn)品適量，測定枳殼藥材供試品溶液加混合對照品中柚皮苷和新橙皮苷的峰面積，計算柚皮苷和新橙皮苷的回收率，柚皮苷平均回收率103.20，RSD＝3.42%，新 橙 皮 苷 平 均 回 收 率100.10，RSD＝1.46%，表明該方法具有良好的回收率。

4 討論

本實驗結(jié)果表明，鹽制枳殼和醋制枳殼可以按此含量測定方法檢測其含量，方法操作簡便，可作為枳殼及其炮制品的質(zhì)量控制方法。麩炒枳殼中的柚皮苷和新橙皮苷含量比其它炮制品要高。可能的原因：果瓤柚皮苷等黃酮類化學(xué)成分的含量僅為原藥材料的一半左右。在枳殼的麩炒過程中，果瓤容易脫落，提高其有效成分的含量。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

［2］ 王孝濤.歷代中藥炮制法匯典（古代部分）［M］.南昌：江西科學(xué)技術(shù)出版社，1986：296－297.

［3］ 顧雪竹，毛淑杰，李先端.枳殼生品、炮制品中有效成分分析［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志.2006，25（12）：15－17.

［4］ 馬新?lián)Q，趙艷，郭曉穎.炮制對枳殼質(zhì)量影響的研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，20（18）：1456.

［5］ 中國中醫(yī)研究院中藥研究所，北京藥品生物制品鑒定所［M］.中藥炮制經(jīng)驗集成.北京：人民衛(wèi)生出版社，1974.