高效液相色譜－蒸發光散射檢測妥布霉素的含量

喬志華

（臨汾市食品藥品檢驗所，山西 臨汾041000）

妥布霉素是具有廣譜抗菌活性的氨基糖苷類抗生素，具有療效高和毒性低的特點。氨基糖甙類抗生素沒有紫外吸收，無法采用紫外檢測器進行檢測。其含量測定一般采用［1－3］生物效價測定法、旋光法、衍生化紫外分光光度法、高效液相色譜衍生化法、薄層色譜法等，近年來已有關于蒸發光散射檢測技術分析氨基糖苷類抗生素的報道出現，而2005年版的中國藥典也已收載了蒸發光散射檢測技術和相關品種。本文建立高效液相色譜－蒸發光散射檢測妥布霉素的含量，報道如下。

1 儀器與試劑

LC－2010 型 高 效 液 相 色 譜 儀（日 本 島 津 公 司）；SEDEX75 型 蒸 發 光 散 射 檢 測 器；VP ODS C18色 譜 柱（4.6mm×250mm，5μm）；三氯醋酸為分析純，甲醇為色譜純，水為蒸餾水。妥布霉素對照品含量91.4%，批號：130527－200403），新霉胺對照品，批號85－1108；卡那霉素B對照品，批號130548－20052，均為中國藥品生物制品檢定所提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：VP ODS C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：0.2mol／L 的三氯醋酸－甲醇（90∶10）；流速：1.0mL／min；蒸發光散射器的漂移管溫度：40℃，霧化氣體壓力為3.5bar（高純氮氣）。

2.2 專屬性考察

精密稱取妥布霉素標準品、卡那霉素對照品和新霉胺標準品，分別置于100mL 容量瓶中，加水至刻度，制成濃度為1mg／mL的溶液，量取5mL 與硫酸溶液（濃度為2×10－3mL／mL）5mL混合作為混合溶液，精密量混合溶液20μL進樣，記錄色譜（圖略）。結果顯示，硫酸根（2.463min）、卡那霉素（4.395min）、新霉胺（4.286min）的色譜峰與妥布霉素（5.257min）峰的分離度分別為14.33、5.96、1.31，卡那霉素和新霉胺這兩種雜質不干擾妥布霉素的測定。

2.3 線性關系考察

對照品配制：精密稱取妥布霉素對照品，置于100mL容量瓶加水稀釋，搖勻，制成199.45μg的溶液，分別進樣20、25、35、45、50、60μL，記錄峰面積。以進樣量所相當濃度的對數（lgC）為橫坐標，峰面積的對數（IgA）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：lgA＝1.1216lgC＋6.537 2（r＝0.999 8，n＝6）。結果，妥布霉素檢測濃度的線性范圍為241.3～1 867.9μg／mL。

2.4 重復性檢查

供試品溶液配制：分別精密稱取妥布霉素和硫酸妥布霉索適量，加水分別制成1mL／mg的溶液，搖勻，即得，平行制備6份。按隨行標準曲線法計算含量，結果妥布霉素的平均含量為73.72%，RSD為0.73%；硫酸妥布霉素中妥布霉素的平均含量為62.41%，RSD 為0.79%，表明本法重復性良好。

2.5 回收率考察

精密稱取已知含量的硫酸妥布霉素樣品適量（分別為濃度高、中、低各3份）和與之相對應量的妥布霉素對照品9份，分別置于50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，取10μL注入液相色譜儀進行測定。計算回收率，測得回收率分別為99.9%，99.7%，99.5%。平均回收率為99.7%，RSD＝0.43%，結果顯示回收率良好。

2.6 樣品含量測定

取妥布霉素對照品溶液，進樣，記錄色譜圖，以進樣量所相當濃度的對數（lgC）為橫坐標，峰面積的對數（IgA）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：lgA＝algC＋b；取供試品溶液，分別平行進樣，測定供試品溶液主峰的平均峰面積（A），并根據對照品標準曲線計算供試品溶液中妥布霉素的濃度［10＾（19A－b）／a］，然后再根據供試品溶液的稱樣量，計算供試品中妥布霉素的含量。結果如表1所示，采用高效液相色譜－蒸發光散射法與生物檢定法含量測定結果相似。

表1 高效液相色譜－蒸發光散射法與生物檢定法含量測定結果 （%）

3 討論

色譜條件的選擇：氨基糖苷類藥物為離子化合物，極性很強，故采用非衍生化的HPLC法時，通常用反相離子對色譜法進行測量。一般的離子對試劑揮發性較差，而全氟化羧酸如三氯醋酸對試劑的揮發性較好，分離效果理想，故本實驗選擇三氯醋酸為流動相［4］。選擇溶劑時，考慮到妥布霉素及硫酸妥布霉素均易溶于水，且水又同時為流動相的主要組成部分，與流動相分別制備溶液測定時，色譜峰的各項參數接近，差異不大，故可選擇水為溶劑。流動相的流速對各成分之間的分離度產生的影響不大，但如果流速過低會導致出峰緩慢、峰形擴散，流速過高又會使柱壓升高。通過實驗得出，選擇1.0mL／min的流速時可得到較為理想的色譜行為。柱溫升高可減少保留時間和增加柱效，但對色譜柱本身會產生一定的影響，減少柱子壽命，40℃為較適合的溫度。檢測器參數的選擇：通過考察不同溫度的檢測結果后，發現檢測器漂移管溫度設置為40℃時，峰響應最大，基線也較平穩、噪音較小。而設置不同的載氣壓考察時，當載氣壓為3.5bar時，基線與色譜響應處于較合適的位置，故采用之。含量測定方法的選擇：根據蒸發光散射檢測器的原理，樣品濃度和檢測器響應之間呈指數關系，轉換成對數可呈線性關系，方便計算。采用微生物檢測法測定含量的結果與本文所用高效液相色譜－蒸發光散射檢測結果相近，但本文方法簡單，快速，更符合實驗操作的要求。

本文建立的高效液相色譜－蒸發光散射檢測妥布霉素的方法與其他方法相比，具有以下優點［5］：不需要進行衍生化，排除了具有與妥布霉素相近理化性質的其他氨基糖苷類化合物的干擾，減少樣品前處理可能產生的誤差，提高了分析準確度。

［1］ 蘇藻.妥布霉素測定方法研究進展［J］.海峽藥學，2004，16（4）：13.

［2］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）［S］.北京：化學工業出版社，2005：270.

［3］ 洪利婭，陳悅，陳貴斌，等.HPLC－ELSD法測定妥布霉素的含量［J］.中國抗生素雜志，2005，30（11）：662.

［4］ 陳寧林，張華艷.高效液相色譜一蒸發光散射檢測妥布霉素的含量［J］.中國醫院藥學雜志，2007，27（9）：1248－1250.

［5］ 顏彥，王康俊.HPLC－ELSD 法測定硫酸妥布霉素注射液含量［J］.中國熱帶醫學，2007，7（9）：1674－1675.