大黃飲片在不同溶劑提取中蒽醌成分的含量分析

刁發(fā)銘，王 磊

（廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州510120）

藥典所載大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum.palmatum L.）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（Rheum off icinale Baill.）的干燥根及根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃之功效［1］，為臨床上用量較大的中藥，其有效成分為蒽醌類化合物［2－4］。本文對(duì)大黃不同溶劑提取時(shí)4種主要蒽醌成分的含量變化進(jìn)行研究，為大黃提取工藝提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀；Agilent C18（4.6mm×250mm，5μm）色譜柱；CP225D 型十萬分之一電子天平（德國Sartorius）。

1.2 試藥與試劑

對(duì)照品蘆薈大黃素（批號(hào)110795－200504）、大黃酸（批號(hào)0757－200206）、大黃素（1109056－200110）和大黃素甲醚（110758－201013），購自中國藥品生物制品檢定所。甲醇、乙腈、乙醇均為市售分析純?cè)噭簧V級(jí)甲醇、乙腈購自德國Merck 公司；雙蒸水由廣東省中醫(yī)院制劑科提供。

1.3 藥材

大黃符合2010版中國藥典一部規(guī)定蓼科植物藥用大黃（Rheum off icinale Baill.）的干燥根及根莖，購自廣東省康美藥材公司，且經(jīng)廣東省中醫(yī)院董玉珍主任中藥師鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相：A 為甲醇，B為0.5%磷酸水溶液，C為乙腈，洗脫梯度：0～5min（9%A，80%B，11%C），5～20min（9%～8%A，80%～72%B，11%～20%C），20～35min（8%～7%A，72%～60%B，20%～33%C），35～50min（7%～5%A，60%～50%B，33%～45%C），50～60min（5%～4%A，50%～36%B，45%～60%C），60～80min（4%～0%A，36%～9%B，60%～91%C）；流速：1mL·min－1；檢測波長：280nm；柱溫：25℃，進(jìn)樣量：5μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品蘆薈大黃素0.97mg、大黃酸1.08mg、大黃素甲醚1.60mg 和大黃素0.97mg，混合后加雙蒸水2mL后用甲醇溶解并定容至10mL 量瓶中，得對(duì)照品混合儲(chǔ)備液。精密吸取混合儲(chǔ)備液5mL，加入1mL 雙蒸水后再用甲醇稀釋并定容至10mL量瓶中，得對(duì)照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

將大黃飲片粉碎，過60目篩，備用。分別精密稱取6份大黃粉末約0.4g，分別置于6個(gè)具塞錐形瓶中，分別精密加入40mL的水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇、95%乙醇，稱定其重量，加熱回流1h，用相應(yīng)的溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻?yàn)V過，取濾液1mL 加20%的甲醇（甲醇：水＝80∶20）定溶到10mL，用0.45μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。每份樣品溶液，平行操作2份。

2.4 專屬性試驗(yàn)

將樣品溶液和空白雙蒸水甲醇溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測，比較兩者的色譜圖，結(jié)果表明經(jīng)本方法處理后，煎液中的雜質(zhì)不干擾蒽醌類物質(zhì)的測定，且空白無干擾，色譜見圖1。4種蒽醌類成分達(dá)到基線分離，且峰形良好。

圖1 大黃（A）、空白（B）色譜

2.5 線性關(guān)系考察

依次精密吸取對(duì)照品 混合溶 液4.0、2.0、1.0、0.5、0.2mL，用20%甲醇依次稀釋并定容至10mL 量瓶中，制成系列濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，0.45μm 的微孔濾膜過濾后直接進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測分析。以4種成分峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得不同對(duì)照品的UPLC 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表1。

表1 4種待測蒽醌組分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性關(guān)系

2.6 精密度試驗(yàn)

吸取混合對(duì)照品溶液2mL 配成10mL 的溶液，連續(xù)進(jìn)樣3次，結(jié)果各蒽醌峰面積的RSD 均小于4.0%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取大黃粉末3份，按“2.3”的水回流提取方法制備供試品，接著按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC檢測分析，連續(xù)3次，結(jié)果各蒽醌峰面積的RSD均小于5.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取40%乙醇提取液的供試品溶液，室溫下，分別于0、4、8、12、16、20、24h進(jìn)行檢測，結(jié)果各蒽醌峰面積的RSD 均小于6.0%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品測定

取制備供試品溶液，每份樣品按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 檢測分析。結(jié)果見表2。

表5 不同溶劑提取時(shí)大黃中蒽醌的提取率 （%）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同提取溶劑中大黃的4個(gè)蒽醌類有效成分進(jìn)行了含量分析，結(jié)果顯示大黃酸、大黃素和大黃素甲醚在60%的乙醇作為溶劑時(shí)的提取率最高，蘆薈大黃素在水及不同濃度的乙醇中的提取率無規(guī)律性變化，4個(gè)蒽醌類有效成分在水中的提取率最低。采用HPLC法分離測定了大黃中4 個(gè)蒽醌類有效成分，方法簡便快速，分離效果好，重現(xiàn)性好。樣品前處理簡單易行，為大黃及含大黃的制劑提供了簡單可靠有效的檢測手段，為含大黃的中藥復(fù)方的配伍研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 邵明立，馬曉偉，吳湞，等.中華人民共和國藥典一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：22.

［2］ 徐慶，覃永俊，蘇小建，等.掌葉大黃化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2009，40（4）：533－536.

［3］ 鄭俊華，果德安.大黃的現(xiàn)代研究［M］.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部出版社，2007.

［4］ 李曉紅，李蒙，陶艷蓉.大黃酸及其衍生物藥理作用研究新進(jìn)展［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2010，25（6）：417－421.