銀杏內(nèi)酯滴丸質(zhì)量控制方法探討

吳洪君

（江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司，江蘇 宜興214200）

銀杏為銀杏科銀杏屬植物，它的果、葉均可作藥用，具有益心斂肺、化濕止瀉等作用。銀杏葉中的銀杏內(nèi)酯具有高度專屬性拮抗血小板活化因子（PLatelet Activating Factor，PAF）的作用，其中內(nèi)酯類化合物有：銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C、銀杏內(nèi)酯M、銀杏內(nèi)酯J及白果內(nèi)酯，研究表明，人與動物的許多細胞在細胞內(nèi)毒素、免疫球蛋白（IgE）、白介素－1（IL－1）和腫瘤壞死因子（TNF）等的刺激下能合成與釋放PAF，而從天然產(chǎn)物中篩選出的銀杏內(nèi)酯，已成為迄今評價最多的拮抗劑，其在心、腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、肝炎、肺炎治療方面顯示較好的應(yīng)用前景［1－2］。目 前已 經(jīng) 有 文 獻 報 道 用HPLC－ELSD 法 測 定 注 射用銀杏內(nèi)酯中銀杏內(nèi)酯A 和B的含量、測定銀杏內(nèi)酯注射液中銀杏內(nèi)酯A 和B的含量［3－5］，但是銀杏內(nèi)酯滴丸的銀杏內(nèi)酯A 和B的含量的測定鮮見報道。本文對銀杏內(nèi)酯滴丸的含量測定方法進行了研究，同時對滴丸中主成分的提取條件進行了篩選，進一步確認了HPLC－ELSD 法測定銀杏內(nèi)酯滴丸中的銀杏內(nèi)酯A 和B的含量是準確、靈敏、快速、可行的。

1 資料與儀器

儀器：Shimadzu LC－10AT 系列HPLC，Alltech ELSD 800蒸發(fā)光散射檢測器。

色譜柱：HypersiLC18（5μ，4.6mm×25cm）；Sartorius BT－25S型電子分析天平。

正丙醇和四氫呋喃：色譜純（默克）；純水：自制純化水。

銀杏內(nèi)酯A：中國藥品生物制品檢定所，批號：0862－200004。

銀杏內(nèi)酯B：中國藥品生物制品檢定所，批號：110863－200204。

銀杏內(nèi)酯滴丸樣品：江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司自制，批號：100107－1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

儀 器：Shimadzu LC－10AT 系列HPLC，Alltech ELSD 800蒸發(fā)光散射檢測器。

流動相：正丙醇－四氫呋喃－水（1∶25∶74）。

流 速：1.0mL／min；柱溫：35℃；漂移管溫度：110℃；氮氣流速2.5mL／min。

2.2 溶液制備和測定方法

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取銀杏內(nèi)酯A 對照品、銀杏內(nèi)酯B 對照品適量，加甲醇制成每mL各含0.5mg、1.0mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品20丸，精密稱定，研細，取細粉適量（約含銀杏內(nèi)酯12mg），精密稱定，置10mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液5μL、10μL，供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數(shù)方程分別計算銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B的含量，即得。

2.3 提取條件的篩選

2.3.1 提取方法的選擇

取研細的本品，精密稱定2 份，每份約含銀杏內(nèi)酯12mg，一份置10mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得；另一份加水10mL，置水浴中溫?zé)崾谷苌ⅲ?%鹽酸溶液2滴，用乙酸乙酯振搖提取4次，合并提取液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密量取上述溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果見表1。

表1 提取方法篩選結(jié)果

結(jié)果表明：樣品直接用甲醇溶解過濾和用乙酸乙酯提取效率基本一致，甲醇溶解過濾雖然空白輔料峰較乙酸乙酯提取大，但不影響含量測定，且操作簡單，誤差較小。

2.3.2 溶劑篩選

取研細的本品適量，精密稱定3份，每份約含銀杏內(nèi)酯12mg，分置3個10mL 量瓶中，分別加入30%、50%、100%甲醇溶液適量，超聲處理30min，取出，放冷，用相應(yīng)的溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，即得。精密量取10μL，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果見表2。

表2 溶劑篩選結(jié)果

結(jié)果表明：30%、50%的甲醇溶液提取效率較低，100%甲醇的最高，故選用甲醇作為提取溶劑。

2.3.3 超聲時間篩選

取研細的本品，精密稱定4 份，每份約含銀杏內(nèi)酯12mg，分置4個10mL 量瓶中，分別加入甲醇適量，分別超聲處理10min、20min、30min和40min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，即得。精密量取10μL，注入液相色譜儀，測定，結(jié)果見表3。

表3 超聲時間篩選結(jié)果

結(jié)果表明：超聲處理20min和30min提取效率基本相當(dāng)，為確保提取完全，故選擇超聲提取30min。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 檢測限

取對照品溶液，經(jīng)逐步稀釋后，進樣，銀杏內(nèi)酯A 的檢測限約為0.05μg，銀杏內(nèi)酯B的檢測限約為0.08μg。

2.4.2 專屬性

按處方比例配制不含銀杏內(nèi)酯的空白滴丸劑，按含量測定方法制成空白溶液，精密量取10μL，注入液相色譜儀，由色譜圖可知，空白輔料不干擾銀杏內(nèi)酯的檢出。

2.4.3 標準曲線

對照品溶液的制備：分別精密稱取銀杏內(nèi)酯A 對照品、銀杏內(nèi)酯B對照品適量，加甲醇制成每mL 各含0.490mg、1.018mg的混合溶液，作為對照品溶液。分別精密量取溶液5、10、15、20、25μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，分別以濃度的對數(shù)為橫坐標，峰面積的對數(shù)為縱坐標，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)，繪制標準曲線，結(jié)果見表4和表5。

表4 銀杏內(nèi)酯A線性范圍試驗結(jié)果

表5 銀杏內(nèi)酯B線性范圍試驗結(jié)果

結(jié)果表明：銀杏內(nèi)酯A 進樣量在2.45～12.25μg·mL－1濃度范圍內(nèi)，銀杏內(nèi)酯B進樣量在5.09 ～25.45μg·mL－1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4.4 溶液穩(wěn)定性

取本品按“2.2.2”制成供試品溶液，每隔2h進樣，結(jié)果表明：8h內(nèi)，銀杏內(nèi)酯A、B的峰面積值基本穩(wěn)定，故可知本品供試品溶液8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 回收率

取本品磨成細粉，精密稱定11份，每份約含銀杏內(nèi)酯6mg，分別置5mL量瓶中，精密量取上述對照品溶液1mL、2mL、3mL各3份于上述稱定的9份樣品中，各量瓶中分別加甲醇適量，超聲處理30min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取對照品溶液5μL、10μL，供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數(shù)方程分別計算銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B的含量，計算回收率。結(jié)果表明：銀杏內(nèi)酯A 的加樣回收率為99.06%，測得的RSD 為1.0%；銀杏內(nèi)酯B 的加樣回收率為98.99%，測得的RSD為0.9%。

2.5 樣品中銀杏內(nèi)酯含量測定

照“2.2.3”項下測定方法測定本品三批銀杏內(nèi)酯含量，平均含量分別為23.32mg／丸、22.76mg／丸和25.61mg／丸，均大于18mg／丸，符合規(guī)定。

3 結(jié)論

銀杏內(nèi)酯的主要成分無C＝C雙鍵和共軛結(jié)構(gòu)，無法采用紫外檢測器檢測，示差檢測器對溫度等外界因素響應(yīng)過于靈敏，用于檢測該品種重現(xiàn)性和檢測靈敏度差。ELSD 屬于質(zhì)量型檢測器，近年來應(yīng)用日趨廣泛［3－5］，且不存在試劑干擾問題，故本研究選用ELSD 檢測器檢測。本研究又通過提取方式、溶劑和提取時間的選擇，確定了提取工藝條件。本研究還進行了一系列的專屬性、線性、回收率、溶液穩(wěn)定性試驗，試驗數(shù)據(jù)證明：采用文中的色譜條件和優(yōu)選出的樣品提取工藝條件來檢測銀杏內(nèi)酯滴丸中的銀杏內(nèi)酯A 和B的含量準確、靈敏、快速、可行。

［1］ 王興鵬，袁耀宗，徐家裕.銀杏苦內(nèi)酯對急性胰腺炎大鼠的治療作用及機制［J］.中國藥理學(xué)通報，1995，11（03）：199－201.

［2］ 李欽，馬鳳仙，程鐵峰.HPLC－ELSD法測定銀杏酮酯滴丸中中萜類內(nèi)酯的含量［J］.中成藥，2007，29（6）：836－838.

［3］ 李林燕，許益清.高效液相色譜法測定銀杏內(nèi)酯B 注射液含量［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2009，28（8）：223－225.

［4］ 李寧，張國慶，趙玉蘭，等.HPLC－ELSD 法測定銀杏內(nèi)酯B注射劑的含量及有關(guān)物質(zhì)［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2007，24（3）：67－69.

［5］ 戴翔翎，凌婭，施瑋，等.HPLC－ELSD 法測定注射用銀杏內(nèi)酯中銀杏內(nèi)酯A 與銀杏內(nèi)酯B 的含量［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2005，21（1）：22－23.