銀杏內酯滴丸質量控制方法探討

吳洪君

（江蘇鵬鷂藥業有限公司，江蘇 宜興214200）

銀杏為銀杏科銀杏屬植物，它的果、葉均可作藥用，具有益心斂肺、化濕止瀉等作用。銀杏葉中的銀杏內酯具有高度專屬性拮抗血小板活化因子（PLatelet Activating Factor，PAF）的作用，其中內酯類化合物有：銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、銀杏內酯M、銀杏內酯J及白果內酯，研究表明，人與動物的許多細胞在細胞內毒素、免疫球蛋白（IgE）、白介素－1（IL－1）和腫瘤壞死因子（TNF）等的刺激下能合成與釋放PAF，而從天然產物中篩選出的銀杏內酯，已成為迄今評價最多的拮抗劑，其在心、腦血管系統、中樞神經系統、血液系統、肝炎、肺炎治療方面顯示較好的應用前景［1－2］。目 前已 經 有 文 獻 報 道 用HPLC－ELSD 法 測 定 注 射用銀杏內酯中銀杏內酯A 和B的含量、測定銀杏內酯注射液中銀杏內酯A 和B的含量［3－5］，但是銀杏內酯滴丸的銀杏內酯A 和B的含量的測定鮮見報道。本文對銀杏內酯滴丸的含量測定方法進行了研究，同時對滴丸中主成分的提取條件進行了篩選，進一步確認了HPLC－ELSD 法測定銀杏內酯滴丸中的銀杏內酯A 和B的含量是準確、靈敏、快速、可行的。

1 資料與儀器

儀器：Shimadzu LC－10AT 系列HPLC，Alltech ELSD 800蒸發光散射檢測器。

色譜柱：HypersiLC18（5μ，4.6mm×25cm）；Sartorius BT－25S型電子分析天平。

正丙醇和四氫呋喃：色譜純（默克）；純水：自制純化水。

銀杏內酯A：中國藥品生物制品檢定所，批號：0862－200004。

銀杏內酯B：中國藥品生物制品檢定所，批號：110863－200204。

銀杏內酯滴丸樣品：江蘇鵬鷂藥業有限公司自制，批號：100107－1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

儀 器：Shimadzu LC－10AT 系列HPLC，Alltech ELSD 800蒸發光散射檢測器。

流動相：正丙醇－四氫呋喃－水（1∶25∶74）。

流 速：1.0mL／min；柱溫：35℃；漂移管溫度：110℃；氮氣流速2.5mL／min。

2.2 溶液制備和測定方法

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取銀杏內酯A 對照品、銀杏內酯B 對照品適量，加甲醇制成每mL各含0.5mg、1.0mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品20丸，精密稱定，研細，取細粉適量（約含銀杏內酯12mg），精密稱定，置10mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得。

2.2.3 測定法

分別精密吸取對照品溶液5μL、10μL，供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數方程分別計算銀杏內酯A、銀杏內酯B的含量，即得。

2.3 提取條件的篩選

2.3.1 提取方法的選擇

取研細的本品，精密稱定2 份，每份約含銀杏內酯12mg，一份置10mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30min，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液即得；另一份加水10mL，置水浴中溫熱使溶散，加2%鹽酸溶液2滴，用乙酸乙酯振搖提取4次，合并提取液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解并轉移至10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。分別精密量取上述溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，結果見表1。

表1 提取方法篩選結果

結果表明：樣品直接用甲醇溶解過濾和用乙酸乙酯提取效率基本一致，甲醇溶解過濾雖然空白輔料峰較乙酸乙酯提取大，但不影響含量測定，且操作簡單，誤差較小。

2.3.2 溶劑篩選

取研細的本品適量，精密稱定3份，每份約含銀杏內酯12mg，分置3個10mL 量瓶中，分別加入30%、50%、100%甲醇溶液適量，超聲處理30min，取出，放冷，用相應的溶劑稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液，即得。精密量取10μL，注入液相色譜儀，測定，結果見表2。

表2 溶劑篩選結果

結果表明：30%、50%的甲醇溶液提取效率較低，100%甲醇的最高，故選用甲醇作為提取溶劑。

2.3.3 超聲時間篩選

取研細的本品，精密稱定4 份，每份約含銀杏內酯12mg，分置4個10mL 量瓶中，分別加入甲醇適量，分別超聲處理10min、20min、30min和40min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液，即得。精密量取10μL，注入液相色譜儀，測定，結果見表3。

表3 超聲時間篩選結果

結果表明：超聲處理20min和30min提取效率基本相當，為確保提取完全，故選擇超聲提取30min。

2.4 方法學考察

2.4.1 檢測限

取對照品溶液，經逐步稀釋后，進樣，銀杏內酯A 的檢測限約為0.05μg，銀杏內酯B的檢測限約為0.08μg。

2.4.2 專屬性

按處方比例配制不含銀杏內酯的空白滴丸劑，按含量測定方法制成空白溶液，精密量取10μL，注入液相色譜儀，由色譜圖可知，空白輔料不干擾銀杏內酯的檢出。

2.4.3 標準曲線

對照品溶液的制備：分別精密稱取銀杏內酯A 對照品、銀杏內酯B對照品適量，加甲醇制成每mL 各含0.490mg、1.018mg的混合溶液，作為對照品溶液。分別精密量取溶液5、10、15、20、25μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，分別以濃度的對數為橫坐標，峰面積的對數為縱坐標，計算線性方程和相關系數，繪制標準曲線，結果見表4和表5。

表4 銀杏內酯A線性范圍試驗結果

表5 銀杏內酯B線性范圍試驗結果

結果表明：銀杏內酯A 進樣量在2.45～12.25μg·mL－1濃度范圍內，銀杏內酯B進樣量在5.09 ～25.45μg·mL－1濃度范圍內，線性關系良好。

2.4.4 溶液穩定性

取本品按“2.2.2”制成供試品溶液，每隔2h進樣，結果表明：8h內，銀杏內酯A、B的峰面積值基本穩定，故可知本品供試品溶液8h內穩定。

2.4.5 回收率

取本品磨成細粉，精密稱定11份，每份約含銀杏內酯6mg，分別置5mL量瓶中，精密量取上述對照品溶液1mL、2mL、3mL各3份于上述稱定的9份樣品中，各量瓶中分別加甲醇適量，超聲處理30min，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。分別精密吸取對照品溶液5μL、10μL，供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定，用外標兩點法對數方程分別計算銀杏內酯A、銀杏內酯B的含量，計算回收率。結果表明：銀杏內酯A 的加樣回收率為99.06%，測得的RSD 為1.0%；銀杏內酯B 的加樣回收率為98.99%，測得的RSD為0.9%。

2.5 樣品中銀杏內酯含量測定

照“2.2.3”項下測定方法測定本品三批銀杏內酯含量，平均含量分別為23.32mg／丸、22.76mg／丸和25.61mg／丸，均大于18mg／丸，符合規定。

3 結論

銀杏內酯的主要成分無C＝C雙鍵和共軛結構，無法采用紫外檢測器檢測，示差檢測器對溫度等外界因素響應過于靈敏，用于檢測該品種重現性和檢測靈敏度差。ELSD 屬于質量型檢測器，近年來應用日趨廣泛［3－5］，且不存在試劑干擾問題，故本研究選用ELSD 檢測器檢測。本研究又通過提取方式、溶劑和提取時間的選擇，確定了提取工藝條件。本研究還進行了一系列的專屬性、線性、回收率、溶液穩定性試驗，試驗數據證明：采用文中的色譜條件和優選出的樣品提取工藝條件來檢測銀杏內酯滴丸中的銀杏內酯A 和B的含量準確、靈敏、快速、可行。

［1］ 王興鵬，袁耀宗，徐家裕.銀杏苦內酯對急性胰腺炎大鼠的治療作用及機制［J］.中國藥理學通報，1995，11（03）：199－201.

［2］ 李欽，馬鳳仙，程鐵峰.HPLC－ELSD法測定銀杏酮酯滴丸中中萜類內酯的含量［J］.中成藥，2007，29（6）：836－838.

［3］ 李林燕，許益清.高效液相色譜法測定銀杏內酯B 注射液含量［J］.醫藥導報，2009，28（8）：223－225.

［4］ 李寧，張國慶，趙玉蘭，等.HPLC－ELSD 法測定銀杏內酯B注射劑的含量及有關物質［J］.現代科學儀器，2007，24（3）：67－69.

［5］ 戴翔翎，凌婭，施瑋，等.HPLC－ELSD 法測定注射用銀杏內酯中銀杏內酯A 與銀杏內酯B 的含量［J］.南京中醫藥大學學報，2005，21（1）：22－23.