大鼠Walker—256移植瘤Cyclin E表達水平與其對化療藥物敏感性的關系

摘要 目的：探究大鼠Walker—256移植瘤中Cyclin E的表達水平同荷瘤大鼠接受化療治療后生存率的關系。方法：建立大鼠Walker—256移植瘤模型，利用隨機表按照安全隨機法隨機分為4組，對照組、阿霉素組、紫杉醇組、絲裂霉素組。分別以生理鹽水、阿霉素組、紫杉醇組、絲裂霉素予以治療。繪制各組大鼠的生存曲線、并檢測各組大鼠移植瘤內Cyclin E的表達水平。以方差分析統計各組之間Cyclin E表達水平的差異，各亞組間荷瘤大鼠的生存率以Wilcoxon法及Kaplan—Meier法進行生存分析。結果：在各組之間，Cyclin E的表達水平無明顯差異（P=0.875）；在各組中，移植瘤內Cyclin E表達水平高的大鼠生存率較低，反之移植瘤內Cyclin E表達水平低的大鼠生存率較高，除絲裂霉素組外（P=1.000），這種差異有顯著的統計學意義（對照組P=0.016，阿霉素組P=0.009，紫杉醇組P=0.043）。結論：Cyclin E表達水平的高低同大鼠Walker—256移植瘤對化療治療的敏感性有關，對乳腺腫瘤患者進行Cyclin E的檢測或可有助于預測患者的化療效果。

關鍵詞 細胞周期蛋白E大鼠Walker—256化療

細胞周期蛋白E（Cyclin E）作為一種重要的G1/S期蛋白在惡性腫瘤的演進中扮演著重要的角色，已經被確認是一種癌基因[1]。近年來有最新研究證實對乳腺癌患者的新輔助化療的失敗也同Cyclin E基因的高表達有關[2]。在之前的臨床研究中也發現在乳腺癌患者中，Cyclin E的高表達者其預后不良[3]；同時也在體外水平對Cyclin E的表達同腫瘤增值的關系進行了相關研究[4]。為了完整地揭示Cyclin E地表達對惡性腫瘤所產生影響，在體內水平以大鼠Walker—256移植瘤為研究對象，探究Cyclin E的表達水平同大鼠荷瘤后的生存率的關系。

資料與方法

實驗材料：Wistar大白鼠81只，體重250～280g，由華中科技大學同濟醫學院醫學動物實驗中心提供。所用化療藥物分別為：鹽酸阿霉素針，鹽酸紫杉醇注射液，絲裂霉素。Walker—256細胞株由武漢市協和醫院普外科實驗室提供。

實驗方法：①大鼠腫瘤模型的制作方法及分組：取1只大鼠以乙醚麻醉后，股內側活力碘消毒，腹腔注射Walker—256癌肉瘤細胞細胞株，5天后自腹腔抽取腹水，顯微鏡下計數腫瘤細胞數，用注射器吸取含1×107個腫瘤細胞的腹水，注射到其它80只大鼠股內側皮下實施腫瘤接種。接種7天后可見接種部位有瘤塊出現，抽樣病理學檢驗證實為Walker—256癌肉瘤。接種9天后當瘤塊達1cm3時，利用隨機表按照安全隨機法將荷瘤大鼠隨機分成4組[5]，對照組、阿霉素組、紫杉醇組、絲裂霉素組，每組各20只。②荷瘤大鼠的處理：各組大鼠均稱重并記錄。對照組均經尾靜脈注射生理鹽水5ml；阿霉素組按照5.33mg/（kg·日）經尾靜脈注射5ml阿霉素給予治療，共注射7天；紫杉醇組按照10.00mg/（kg·日）經尾靜脈注射阿霉素紫杉醇給予治療，共注射7天；絲裂霉素組按照30.00mg/（kg·日）經尾靜脈注射5ml絲裂霉素給予治療，共注射7天。實驗組荷瘤大鼠所使用的化療藥物劑量，按照成人化療藥物的標準使用劑量乘以動物及人之間藥物等效劑量的換算系數后得出[6]?；熃Y束后記錄每只大鼠的自然死亡時間。③腫瘤細胞Cyclin E表達水平的檢測：所有大鼠死亡后，取出腫瘤組織，以10%甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續切片。抗原的檢測均使用免疫組織化學中的SP法染色。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。Cyclin E（C—19sc—198）單克隆抗體，SP試劑盒購。具體操作按照試劑盒操作說明進行。結果以出現細胞核或伴細胞質著色判斷為陽性，根據陽性細胞所占比例及細胞染色強度進行半定量。從每片中選取5個高倍（×400）視野，每視野計數100個細胞。參照姚廣裕等的方法[7]，將陽性細胞計數比例<10%計0分，陽性細胞計數比例10%～40%計1分，40%～70%計2分，>70%計3分，以5個視野的平均比例計算最后的分數；陽性染色的強度則從無染色，弱染色到強染色依此計0、1、2、3分。兩項得分相加后0分為“—”，1～2分為“（+）”，3～4分為“（++）”，5～6分為“（+++）”。將“（—）”及“（+）”定義為“Cyclin E低水平表達組”，而具有“（++）”及“（+++）”定義為“Cyclin E高水平表達組”，從而將每組大鼠按照Cyclin E表達水平分為了兩個亞組，其中Cyclin E低表達組命名為A組，而Cyclin E高表達組命名為B組。分別為兩個亞組大鼠繪制生存曲線。

統計學處理：統計學分析采用SPSS15.0軟件進行，對各組Cyclin E染色的平均得分進行正態分布檢驗，并進行方差齊性檢驗。對成組設計的多個樣本均數比較采用方差分析（ANOVA），按照F檢驗統計計算各組之間Cyclin E表達水平的差異，各亞組間荷瘤大鼠的生存時間為非正態分布，以非參數檢驗Kaplan—Meier以及Wilcoxon方法（Z檢驗）進行生存分析。均以P<0.05為有顯著統計學差異的檢驗標準。

結果

各組之間大鼠腫瘤細胞Cyclin E的表達水平：各組之間荷瘤大鼠Cyclin E的表達水平的平均得分符合正態分布，各總體方差齊性檢驗是相等的（Levene Statistic=0.079，P=0.971）經方差分析發現各組間Cyclin E表達水平的差異無統計學意義（P=0.907）。

對照組大鼠的生存時間與Cyclin E表達水平的關系：通過對照組大鼠的生存時間及生存曲線可見Cyclin E表達水平低的大鼠生存時間較長，且組間生存時間的差異有很顯著的統計學意義（P=0.016）。

阿霉素組大鼠的生存時間與Cyclin E表達水平的關系：通過阿霉素組大鼠的生存時間及生存曲線可見Cyclin E表達水平低的大鼠生存時間較長，且組間生存時間的差異有很顯著的統計學意義（P=0.009）。

紫杉醇組大鼠的生存時間與Cyclin E表達水平的關系：通過紫杉醇組大鼠的生存時間及生存曲線可見Cyclin E表達水平低的大鼠生存時間較長，且組間生存時間的差異有很顯著的統計學意義（P=0.043）。

絲裂霉素組大鼠的生存時間與Cyclin E表達水平的關系：通過絲裂霉素組大鼠的生存時間及生存曲線可見Cyclin E表達水平低的大鼠生存時間較長，但組間生存時間的的差異沒有顯著的統計學意義（P=1.000）。

討論

在惡性腫瘤的發生和演進的過程中，細胞周期調控的紊亂是造成細胞增殖失控的主要原因之一。在對細胞周期的調控中，細胞周期素（Cyclins）起著至關重要的作用，而這一家族中的Cyclin E作為G1期Cyclin，是重要的細胞周期限速調節因子。除了極少數腫瘤外，在多種惡性腫瘤，包括乳腺癌組織中都發現有Cyclin E基因的擴增和Cyclin E的過度表達[8]。近來國內外很多研究者都開始注意到Cyclin E在判斷各類惡性腫瘤的預后和治療方面所展現出來的價值，并在各項研究中取得了一定的進展[9，10]。

目前臨床上對乳腺惡性腫瘤患者的治療，除手術外，化療是最為重要及有效的手段[11]，但是患者對化療藥物不敏感，甚至產生耐藥和抵抗是造成治療效果不佳的重要原因之一[12]。認為Cyclin E作為一個重要的細胞周期蛋白，不僅是從腫瘤細胞的增殖方面促進腫瘤生長，也有很大可能間接導致了腫瘤細胞對化療藥物的不敏感。

之前已經從臨床及體外試驗角度，闡述了Cyclin E的表達同腫瘤增值生長的相關性，現在我們試圖通過動物體內實驗水平多角度探究Cyclin E同腫瘤預后以及對化療敏感性的關系。另一方面，目前國內外對于Cyclin E的表達同間皮來源的惡性腫瘤—癌肉瘤之間關系的研究相對較少，但是大部分研究也傾向于認為Cyclin E的表達同預后存在相關性[13，14]。

實驗表明：不同化療藥物對大鼠移植瘤的處理并不會影響Cyclin E在腫瘤組織中的表達，Cyclin E的表達是一個獨立的事件。在未予藥物處理的對照組，Cyclin E高表達的大鼠生存率明顯低于Cyclin E低表達的小鼠，且這一差異存在顯著的統計學意義。在化學藥物治療組中，選取了三種在臨床上具有一定代表性的化療藥物進行比較實驗，發現在阿霉素組，紫杉醇組中，荷瘤大鼠對化療藥物的敏感性受其腫瘤組織內Cyclin E表達水平的影響，通過生存曲線我們可以看到：Cyclin E高表達者對化療相對不敏感，大鼠生存率較低；反之Cyclin E低表達者對化療較敏感，大鼠生存率較高。并且這兩組都體現出了比較一致的趨勢，且差異有顯著的統計學意義。而在絲裂霉素組，雖然也有Cyclin E高表達的大鼠生存率較低的表現，但是沒有體現出明顯的統計學差異，這可能與該化療藥物不是一線化療用藥，對腫瘤的殺傷作用較弱，股對生存時間的影響較小。本研究在一定程度上提示了Cyclin E同惡性腫瘤患者的預后確實存在緊密聯系，而聯系這兩者的紐帶可能就是不同Cyclin E表達水平的患者對化療藥物的不同敏感性：Cyclin E的高表達可能導致腫瘤細胞對化療藥物的不敏感。

進一步猜測Cyclin E表達水平能影響腫瘤對化療敏感性這一特性可能是同Cyclin E促進細胞進入S期的功能相關的。其具體機制尚有待進一步探尋，但是至少通過本研究可以提示我們可否通過阻斷Cyclin E效應通路或者抑制Cyclin E的體內合成的方法，來提高腫瘤對化療的敏感性；或者可否在臨床上通過檢測患者體內Cyclin E的表達水平，來幫助判斷患者化療的療效以致判斷其預后—希望本研究的結果能夠成為開拓這一領域相關進一步研究的實驗基礎。

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