細菌內毒素檢測無法完全取代家兔熱原法

關鍵詞 細菌內毒素熱原鱟試劑試驗用家兔

在藥品藥理檢測中，目前有兩種常用的熱原檢測方法細菌內毒素法（鱟試劑法）和家兔法。雖然細菌內毒素檢測法具有簡便、快速、靈敏、重現性好等優點，且原來許多利用家兔熱原檢查法檢測的藥品均被細菌內毒素檢查法所替代。但由于部分中藥注射劑成分較復雜無法通過稀釋法消除干擾，再加上鱟試劑對革蘭陰性菌以外的內毒素不夠靈敏，故細菌內毒素檢測法無法完全取代家兔熱原檢測法。

概述

熱原系指由微生物產生的能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質。它包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。通常所指的“熱原”，主要是指細菌性熱原，是某些細菌的代謝產物、細菌尸體及細菌內毒素。可見細菌內毒素是熱原之一種。

細菌內毒素一般可分為外毒素和內毒素兩類：外毒素是一種毒性蛋白質，是細菌在生長過程中分泌到菌體外的毒性物質，產生外毒素的細菌主要是革蘭陽性菌。內毒素是革蘭陰性菌細胞壁的產物，一般活體細菌不會產生，只有當細菌死亡或黏附在其它細胞時，才會釋放出內毒素，而脂多糖是內毒素的主要成分，具有特別強的熱原活性。

熱原按檢查法可分為兩種，一種是內毒素熱原，是革蘭陰性細菌細胞壁的組分；另一種是非內毒素熱原，除內毒素外的熱原。目前熱原常用的檢測方法主要是家兔法和細菌內毒素檢測法（鱟試劑法）。熱原檢查法（家兔法）可用于檢測上述兩種原因產生的熱原反應；細菌內毒素檢查法只檢測產品的細菌內毒素含量。當前醫藥工業中普遍接受的觀點是：在生產質量管理規范（GMP）條件下控制內毒素污染就等于控制了熱原污染，這也是內毒素檢查法迅速普及的原因。

熱原檢查法

家兔熱原檢測法的建立：由于家兔對熱原的反應與人基本相似，所以半個世紀以來用家兔來檢測熱原，為保障藥品質量和人類用藥安全發揮了重要作用。目前家兔法仍為各國藥典規定的檢查熱原的法定方法。《中國藥典》2010年版規定的熱原檢查法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內，在規定時間內，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規定。家兔熱原檢測的優點是能夠反映熱原引起哺乳動物復雜的升溫過程，該方法不但能檢測出細菌內毒素的致熱原，也能檢測出非細菌內毒素的致熱原，并且適用于檢測較多種類的熱原物質。

家兔法的發展和影響因素：影響家兔熱原檢測實驗結果的因素很多，檢查結果的準確性和一致性取決于試驗動物的狀況、試驗室條件和操作的規范性。家兔熱原檢測法是以靜脈注射供試品使家兔體溫改變為基礎。這就要求供試用的家兔精神、食欲、排泄等不得有異常，應健康合格。飼養合格家兔的動物室和試驗室環境，其空氣凈化程度、換氣次數、溫濕度、沉降菌、照度、噪聲等應符合國家《實驗動物環境及設施》的要求。另一方面，試驗人員的操作步驟要規范，操作技巧應嫻熟，在進行試驗時，嚴禁閑雜人員進入，更不得高聲喧嘩，給供試用家兔帶來影響。因此，只有同時避免飼養環境、試驗環境、試驗人員的操作和家兔自身的因素等的影響，供試用家兔的體溫才能保持穩定性和均一性，試驗結果才能準確可靠。

由于我國中藥品種較多，其成分含量復雜，無法排除細菌內毒素法中的干擾，必須使用家兔熱原法進行檢查。

細菌內毒素檢測法（鱟試劑法）

細菌內毒素檢測法的建立：1956年美國人Bang發現美洲鱟血液遇革蘭陰性菌時會產生凝膠。其后Levin和Bang又研究出微量革蘭陰性菌內毒素遇鱟血液也可以引起凝膠反應，從而創立了鱟試劑檢測法。由于鱟試劑法簡單﹑快速﹑靈敏﹑準確，目前已廣泛用于臨床、制藥工業藥品檢驗等方面。

細菌內毒素檢測法的發展：在美國，鱟試驗被稱作“細菌內毒素試驗（Bacterial Endotoxin Test）收載于1980年20版美國藥典。隨后英、德、意、日以及中國相繼在藥典中收載了這一檢查法。2005年版《中國藥典》規定168個品種進行細菌內毒素檢查，到2010年版《中國藥典》又新增修訂細菌內毒素檢查的品種達112種，共計270個品種。

《中國藥典》2010年版規定的細菌內毒素檢測法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。細菌內毒素的量用內毒素單位（EU）來表示。

細菌內毒素檢查包括凝膠法和光度測定法兩種方法，前者利用鱟試劑與細菌內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素；后者包括濁度法和顯色基質法，系分別利用鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化及產生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少來測定內毒素。其中廣泛使用，權威的檢測方法為凝膠法。

鱟試劑法檢查內毒素的靈敏度0.0001μg/ml，比家兔法靈敏10倍，操作簡單易行，試驗費用低，結果迅速可靠，適用于注射劑生產過程中的熱原控制和家兔法不能檢測的某些細胞毒性藥物制劑。但其對革蘭陰性菌以外的內毒素不靈敏，再加上部分藥品由于自身特殊性無法通過稀釋法消除干擾，因此鱟試驗還無法完全取代家兔熱原試驗。