反相HPLC法測定雷公藤內酯醇的含量和有關物質

摘要 目的：建立反相高效液相色譜法，測定雷公藤內酯醇的含量和有關物質。方法：采用Discovery SUPELCO C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水為流動相，含量等度洗脫測定、有關物質梯度洗脫測定，檢測波長219 nm，柱溫25 ℃。結果：雷公藤內酯醇含量測定方法中，樣品溶液在8～48 μg/ml濃度范圍內線性關系良好（R2= 1.000 0），平均回收率為99.48%，RSD為0.59%，溶液穩定性好。結論：方法快速、準確，專屬性好，靈敏度符合測定要求。

關鍵詞 雷公藤內酯醇 雷公藤內酯酮 梯度洗脫 高效液相色譜

中圖分類號：O657.72； R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2012）21-0049-04

雷公藤內酯醇是第一個被確認具有松香烷結構的二萜類三環氧內酯化合物。自1936年以來從雷公藤中已分離出多種有效成分，主要是生物堿類、二萜類、三萜類、倍半萜類及多糖，其中二萜類物質雷公藤內酯醇為主要有效藥理成分，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種生物活性[1]；此外，雷公藤內酯醇能誘導T細胞的凋亡，抑制多種在自身免疫系統疾病和排異反應中起重要作用的前致炎細胞因子的表達[2]。目前本品標準尚未收錄于中國藥典，文獻資料多報道雷公藤藥材或制劑中雷公藤內酯醇提取物的含量測定[3，4]。本文根據樣品來源特點及質量控制關鍵點，針對雷公藤內酯醇試制品及其主要雜質內酯酮的質量監測，采用乙腈-水為流動相體系[5]，研究并建立高效液相色譜方法，可快速、準確測定雷公藤內酯醇的含量和有關雜質。

1 儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀，DAD檢測器。色譜柱為Discovery SUPELCO C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）。雷公藤內酯醇試制品：上海皓元化學科技有限公司（批號：20070430、20070604、20070911、20071025）；雷公藤內酯醇標準品：中國藥品生物制品檢定所（批號：111567-200502，20 mg/支）；乙腈：色譜純（Fisher試劑）；水：純化水（密理博純水儀制備）。

2 試驗方法與結果[6]

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件和系統適用性

流動相：乙腈-水（24∶76）；流速：1 ml/min；檢測波長：219 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μl。理論板數按雷公藤內酯醇峰計算應不低于5 000，雷公藤內酯醇和雷公藤內酯酮峰的分離度應大于1.5。

2.1.2 線性關系

2.1.3 精密度試驗（重復性）

2.1.4 穩定性測定

2.1.5 回收率試驗

2.1.6 定量限

2.2 有關物質檢測方法

2.2.1 色譜條件和系統適用性

2.2.2 專屬性考察

2.2.3 靈敏度試驗

取2.1.2項下濃度8 μg/ml的溶液，再等比稀釋成一系列濃度的溶液，取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算信噪比。當濃度為0.04 μg/ml時，其S/N≈3，最小檢測限為0.4 ng，靈敏度符合測定要求。

2.3 三批樣品測定結果

3 討論

雷公藤內酯醇不溶于水，溶于二甲亞砜、甲醇、乙腈等有機溶劑，并在這些溶劑中穩定，在配制溶液時應先用適量乙腈溶解，再用流動相稀釋。在預試驗時考察甲醇-水、乙腈-水不同流動相體系，結果表明以乙腈-水為流動相系統梯度洗脫時，待測組分雷公藤內酯醇、內酯酮與其它組分能有效分離，結果準確可靠，峰形更好。另外，將雷公藤內酯醇和內酯酮的混合對照品在200～400 nm范圍內進行掃描，最大吸收波長為219 nm，故最終選擇乙腈-水作為流動相梯度洗脫，219 nm作為檢測波長。

本研究用的雷公藤內酯醇試制品是從天然植物雷公藤根皮或葉子中提取得到的，工藝過程是以醇水浸提植物、濃縮、水洗、氯仿提取、過柱、丙酮重結晶等流程得到的。本研究目的是建立一種適應樣品來源的HPLC分析方法，作為一種定量分析方法，重復性好（RSD<0.2%）、線性關系良好（R2=1.000）及準確性高。有關物質的分析方法為梯度洗脫，具有較高的專屬性，尤其是對其中的雷公藤內酯酮的控制，為雷公藤內酯醇試制品的質量控制提供了快速、準確的方法。

此外，該試制品是我公司一類新藥雷騰舒的起始原料，其品質將直接影響成品的質量情況和穩定性，因此建立穩定、可靠的質量控制指標，從源頭把好質量關，非常重要。本研究針對雷公藤內酯醇含量、有關物質這兩個關鍵質量項，建立了方法，并通過詳細的驗證確保方法的準確、可靠和可重復，為成品的質量提供了良好的保障。

參考文獻

[1] 段冶， 魏晨， 張學強. HPLC法檢測雷公藤超聲提取物中雷公藤內酯醇的含量[J]. 中醫藥信息， 2009， 26 （1）： 79-80.

[2] Brinker AM， Raskin I. Determination of triptolide in root extracts of Tripterygium wilfordii by solid-phase extraction and reverse-phase high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr A， 2005， 1070 （1-2）： 65-70.

[3] 張志勇， 陳潔， 程艷霞， 等. 高效液相色譜法測定海棠合劑中雷公藤內酯醇含量[J]. 中國醫院藥學雜志， 2005， 25（2）： 120-121.

[4] 喻錄容， 劉新， 明遜， 等. HPLC法測定雷公藤緩釋膠囊中雷公藤內酯醇的含量[J]. 重慶醫科大學學報， 2006， 31（1）： 117-118+133.

[5] 褚克丹， 李煌， 徐偉， 等. HPLC法測定雷公藤內酯醇和內酯酮的含量[J]. 福建中醫藥大學學報， 2011， 21（5）： 27-29.

[6] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2010年版（二部）[M]. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2010： 194-195， ⅩⅨA.

（收稿日期：2012-07-03）