鯰魚體表黏液IgM的分離純化及其抑菌活性研究

摘要：依次采用硫酸銨分級沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析法從鯰魚體表黏液中分離純化IgM，并對其抑菌活性進行了檢測。通過試驗可以得出，凝膠層析的最佳分離條件為：0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液、洗脫速度為0.3 mL/min。鯰魚體表黏液中提取的IgM對大腸桿菌抑菌作用最強，其次是枯草芽孢桿菌，對藤黃微球菌抑菌效果最不明顯。在低溫貯存時溫度控制在0～4 ℃，有助于保持其抑菌活性，但隨著時間的延長，抑菌活性也會逐漸減弱。

關鍵詞：鯰魚；體表黏液；IgM；分離純化；抑菌活性

中圖分類號：S917.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0636-03

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）能凝集細菌，中和病毒，并能在體內其他因素的參與下徹底殺死細菌和病毒，增強機體的免疫功能[1]。免疫球蛋白可用于食品的防腐保鮮，食品中病原菌、有毒成分和功能性成分的快速檢測等[2]。國內外對魚類免疫球蛋白的研究較多[3-6]，但關于魚類黏液中免疫球蛋白抑菌活性方面的研究卻很少。本試驗對鯰魚體表黏液中的IgM進行分離純化，并對其抑菌活性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯰魚取自天津市西青區楊柳青漁場。

SephadexG-200，Pharmacia公司產品；ELISA試劑盒，美國Adlitteram Diagnostic Laboratories公司產品；營養瓊脂、牛肉膏、氯化鈉、蛋白胨購自天津翔天科技有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）均由天津農學院基礎部微生物實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 鯰魚體表黏液IgM的分離純化 將鯰魚皮用蒸餾水浸泡一段時間，攪拌，取上清液，用紗布將上清液過濾，去除較大的雜質，備用。取黏液后采用硫酸銨分級沉淀進行粗分離，然后再采用離子交換層析進一步分離純化[7]。

離子交換層析后再采用凝膠過濾層析，分離參數選取如下：柱長70 cm，直徑1.6 cm，流速0.3 mL/min，洗脫液分別為0.01 mol/L pH 8.0的PBS、0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl，每5 min收集1管，280 nm波長下檢測，收集活性峰后冷凍干燥。將干燥后的樣品配制成50 mg/L的溶液，采用ELISA試劑盒測定IgM濃度，計算純度。選出最優洗脫液后，采用最優洗脫液進行后續參數選擇。分別選取洗脫速度為0.1、0.3、0.6 mL/min，每5 min收集1管，280 nm波長下檢測，收集活性峰后冷凍干燥。將干燥后的樣品配制成50 mg/L的溶液，采用ELISA試劑盒測定IgM濃度，計算純度。凝膠層析過程中，樣品的吸光度越大IgM純度越高。

1.2.2 鯰魚體表黏液IgM抑菌活性的測定 分別選取革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，檢測分離純化后的IgM的抑菌效果。革蘭氏陽性菌包括藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌，革蘭氏陰性菌為大腸桿菌。參照楊光等[8]的濾紙片法進行抑菌試驗。

制備大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的菌懸液，在無菌操作臺內進行抑菌試驗操作。每種菌懸液分別接種3個培養皿，用無菌涂布器將菌懸液涂布均勻。將冷凍干燥后的IgM樣品配制成濃度為1%、2%、3%、4%、5%的抑菌液，濾紙片分別在上述不同濃度的抑菌液中浸泡1 min，取出晾微干，空白對照不做任何處理，每個培養皿均勻放置6個濾紙片。然后將培養皿倒置于恒溫箱中，37 ℃培養24 h，觀察各培養皿的變化情況。

1.2.3 鯰魚體表黏液IgM最小抑菌濃度（MIC）的確定 由試驗1.2.2得出鯰魚體表黏液IgM對大腸桿菌的抑菌效果最好，對枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌的抑菌效果不明顯，因此，針對大腸桿菌進行最小抑菌濃度試驗。用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基培養大腸桿菌。將冷凍干燥后的IgM配制成濃度為0.13%、0.25%、0.50%、1.00%、2.00%的樣品溶液。在各培養皿內分別加入2 mL不同濃度的樣品溶液，每個濃度重復3次。向各培養皿內倒入15～20 mL培養基，輕輕搖動使其充分混勻。待冷卻凝固后，向各培養皿內加入0.2 mL菌懸液，涂勻，用蒸餾水作對照。37 ℃恒溫培養24 h，取出觀察結果。以完全沒有菌落生長的樣品溶液最低濃度為最小抑菌濃度。

1.2.4 不同貯藏溫度下鯰魚體表黏液IgM的抑菌活性變化 試驗共進行30 d。將冷凍干燥后的IgM配制成5%的樣品溶液，分別貯存于0～4 ℃、20～25 ℃條件下，于1、8、15、22、29 d測定IgM的抑菌活性。

2 結果與分析

2.1 IgM分離純化結果

鯰魚體表黏液經離子交換層析后進行凝膠層析，采用ELISA試劑盒檢測IgM濃度，通過跟蹤測試，在第一個洗脫峰中有集中反應。收集活性峰，采用ELISA試劑盒測定IgM濃度并計算純度。由圖1可知，2種緩沖液分離純化后的IgM純度差距不大，但0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl（純度82.83%）的洗脫效果要略好于0.01mol/L pH 8.0的 PBS（純度76.35%）。因此，采用0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl作為分離純化的洗脫液。

收集活性峰，采用ELISA試劑盒測定IgM活性成分計算純度。由圖2可知，洗脫速度為0.3 mL/min時IgM純度最高，純度為83.27%，確定分離純化的最佳流速為0.3 mL/min。因此，分離純化的最佳緩沖液為0.02 mol/L pH 8.0的Tris-HCl，洗脫速度為0.3 mL/min。

通過硫酸銨分級鹽析提取得到的IgM為粗分離產品，其純度較低，不能滿足用于制備較高純度樣品的要求，經鹽析沉淀后還需采用離子交換層析和凝膠層析以獲取純度較高的IgM。離子交換法具有濃縮效果，可用于IgM的大量制備，但是通常情況下分離效果較凝膠過濾法差，要得到純度較高的IgM一般還要結合凝膠過濾法聯合使用，如王先磊等[4]采用DEAE-纖維素-52離子交換結合Sepharose 6B凝膠層析分離純化牙鲆血清IgM。本試驗在離子交換層析后再經過凝膠過濾層析，IgM樣品純度得到很大提高，純度達83%以上，這與陳垚等[9]分離純化鯽魚血清IgM得到的純度（80%）相近。

2.2 鯰魚體表黏液IgM的抑菌活性

不同濃度的IgM對3種細菌抑菌效果如表1所示。從表1可以看出，鯰魚體表黏液IgM對大腸桿菌的抑菌效果最好，這可能是由于所提取的IgM主要是針對大腸桿菌的原因。隨著IgM濃度的增加，IgM對枯草芽孢桿菌也表現出了一定的抑菌效果，但是抑菌作用不明顯，可能是由于所提取的IgM針對這種指示菌的特異性抗體含量低的原因所致。對藤黃微球菌的抑菌效果最弱。

2.3 鯰魚體表黏液IgM的最小抑菌濃度

鯰魚體表黏液IgM對大腸桿菌的抑菌效果最好，因此，選用大腸桿菌進行最小抑菌濃度測定試驗，結果如表2所示。由表2可以得出，鯰魚體表黏液IgM對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.50%。

2.4 不同貯藏溫度下鯰魚體表黏液IgM的抑菌活性變化

不同貯藏溫度下，鯰魚體表黏液IgM的抑菌活性變化如圖3所示。由圖3可知，在0～4 ℃條件下貯藏時IgM具有較強的抑菌活性，隨著貯存時間的延長，IgM的抑菌活性逐漸下降，但下降幅度不大；在室溫（20～25 ℃）條件貯藏8 d時IgM抑菌作用明顯，但之后抑菌活性迅速減弱，至試驗結束時基本無抑菌效果。試驗結果表明，低溫貯存有助于維持IgM的抑菌活性，長時間在室溫條件下保存會破壞IgM的抑菌活性。

3 小結與討論

本試驗結果表明，IgM對大腸桿菌的抑菌效果最好。從鯰魚體表黏液中提取的IgM的抑菌活性對目標菌有選擇性，這種選擇性普遍存在，如Hjelmeland等[10]在虹鱒體表黏液中純化出的蛋白酶對革蘭氏陰性菌有較強的殺菌作用；魚精蛋白提取物對金黃色葡萄球菌有抑菌作用，但對霉菌沒有抑菌作用[11]；蜂膠提取物對革蘭氏陽性菌的抑菌作用比革蘭氏陰性菌強[12]。不同種類的魚其體表黏液中的IgM對各種微生物表現出的抑菌性能不同，這種差異與其生活的水體環境有關，因為IgM是機體特異性免疫的產物，是針對環境中的特異性抗原物質（包括病原菌）而產生的。然而，當水體環境改變時，魚體表黏液中的IgM的特異性是否改變，還有待進一步研究，這對IgM的具體應用具有指導意義，可避免應用的盲目性。IgM對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.50%。經試驗發現，雖然IgM對革蘭氏陰性菌大腸桿菌抑菌效果很好，但對革蘭氏陽性菌的抑菌效果都不理想，IgM的抑菌作用表現出一定的局限性，其原因還有待進一步研究。

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