光照和漂白粉對白僵菌孢子萌發(fā)及致病力的影響

摘要：研究人工紫外光和自然光照射以及消毒劑漂白粉對白僵菌（Beauveria bassiana）孢子萌發(fā)和致病力的影響。結(jié)果表明，人工紫外光照射對裸露的白僵菌孢子有明顯的殺傷作用，使孢子萌發(fā)率和對家蠶（Bombyx mori L.）的致病力明顯下降，但對白僵菌原粉中的孢子殺傷力相對較弱，照射24 h后白僵菌原粉對家蠶的致死率仍達(dá)93.33%。在自然光下，噴灑到桑葉上的白僵菌孢子懸浮液隨光照時間的增加對家蠶的致病力下降，自然光照射3、6、12、24、36 h后，對家蠶的致死率分別為100.00%、70.00%、79.66%、10.00%和25.00%；用白僵菌原粉噴桑樹，經(jīng)自然光照射0～36 h后，對家蠶的致死率為88.33%～96.67%，48 h后對家蠶的致死率大幅度下降，照射48、54、78 h對家蠶的致死率分別為53.33%、31.67%和23.33%；直接置于自然光下照射的白僵菌原粉，隨光照時間增加，對家蠶的致病力下降，30 h后致病力明顯下降，致死率只有38.33%。有效氯濃度為1.00%和2.00%的漂白粉溶液對白僵菌孢子萌發(fā)有很強(qiáng)的抑制作用，72 h孢子萌發(fā)率分別為1.000%和0；用有效氯濃度為2.00%的漂白粉液進(jìn)行葉片和蠶體消毒處理對白僵菌孢子均有殺滅效果，使白僵菌孢子液和原粉對家蠶的致病力明顯下降，但對葉片消毒比對蠶體消毒效果好。

關(guān)鍵詞：白僵菌（Beauveria bassiana）；致病力；光照；漂白粉；家蠶（Bombyx mori L.）

中圖分類號：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0583-05

中國是世界上最大的蠶絲生產(chǎn)國，目前蠶絲產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的80%以上。全國共有蠶農(nóng)2 000多萬戶，分布于20多個省區(qū)[1]。蠶業(yè)已成為中國農(nóng)村經(jīng)濟(jì)中的重要組成部分，其年出口創(chuàng)匯額在農(nóng)產(chǎn)品中位居前列，是農(nóng)民增收的重要來源。家蠶白僵病是由白僵菌引起的一種真菌性病害，是家蠶主要病害之一，發(fā)生流行范圍廣，在世界各蠶區(qū)都有發(fā)生[2]。根據(jù)孢子形態(tài)可以將白僵菌分為球孢白僵菌[Beauveria bassiana （Bals.） Vuillemin]和布氏白僵菌[B. brongniartii （Sacc.） Petch][3]。球孢白僵菌的寄生范圍廣，能夠侵染鱗翅目、鞘翅目、同翅目、膜翅目、雙翅目等15個目149科707種昆蟲[4，5]。近幾年廣西蠶繭主產(chǎn)區(qū)局部暴發(fā)家蠶白僵病，使很多蠶農(nóng)遭受重大損失，嚴(yán)重影響了廣西養(yǎng)蠶業(yè)的健康發(fā)展。據(jù)調(diào)查，2008年廣西來賓市象州縣在5～6月家蠶白僵病發(fā)病率達(dá)30%；2009年廣西蠶繭主產(chǎn)區(qū)宜州市從5月上旬開始暴發(fā)家蠶白僵病[6-8]。因此，有效控制該病的發(fā)生和危害已是當(dāng)務(wù)之急。本研究探討人工紫外光和自然光照射及消毒劑漂白粉對白僵菌孢子萌發(fā)和致病力的影響，以期為家蠶白僵病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

白僵菌原粉：廣西環(huán)江縣白僵菌廠生產(chǎn)。

白僵菌菌株：由白僵菌原粉經(jīng)室內(nèi)用PPDA培養(yǎng)基分離純化獲得。經(jīng)形態(tài)和分子鑒定為球孢白僵菌（Beauveria bassiana Vuillemin）。

供試家蠶（Bombyx mori L.）：兩廣二號家蠶品種，廣西蠶業(yè)技術(shù)推廣總站提供。

1.2 方法

1.2.1 白僵菌原粉對家蠶致病力測定 白僵菌原粉處理蠶體：用白僵菌原粉對蠶體噴粉，噴白僵菌原粉后的家蠶放到直徑15 cm的培養(yǎng)皿中正常飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度（25±1）℃，相對濕度90%。每處理設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)20頭家蠶。每個重復(fù)噴1 g白僵菌原粉，設(shè)蠶體不噴白僵菌原粉為對照。飼養(yǎng)14 d，觀察家蠶生長狀況，統(tǒng)計累計死亡率。死亡蠶體保濕培養(yǎng)，檢查是否有菌絲和分生孢子長出，統(tǒng)計白僵蠶數(shù)。白僵菌原粉處理桑葉：用白僵菌原粉噴桑葉，使桑葉兩面附著一層薄菌粉，再用這些桑葉飼喂健康家蠶，家蠶取食24 h后換干凈新鮮桑葉正常飼喂。飼養(yǎng)溫度（25±1）℃，相對濕度90%。每處理設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)20頭蠶。設(shè)桑葉不噴白僵菌原粉為對照，飼養(yǎng)14 d，觀察家蠶生長狀況，統(tǒng)計累計死亡率，死亡蠶體保濕培養(yǎng)，檢查是否有菌絲和分生孢子長出，統(tǒng)計白僵蠶數(shù)。

1.2.2 白僵菌分離菌株對家蠶的致病力測定

1）孢子懸浮液制備。取已培養(yǎng)好的白僵菌平板（各菌株均采用第二代培養(yǎng)孢子），加入約10 mL 0.1%吐溫-80無菌水，用涂布器在平板上輕輕涂布以便將菌體表面的孢子刮下，然后用移液器將孢子懸浮液吸至已滅菌的50 mL三角瓶內(nèi)，瓶中預(yù)先放置數(shù)粒滅菌玻璃球，充分振搖后用5層滅菌的紗布過濾。用血球計數(shù)板計數(shù)濾液孢子數(shù)，并計算出孢子濃度。然后將原液按試驗要求配制成相應(yīng)濃度的孢子懸浮液備用。

2）孢子懸浮液對家蠶的致病力測定。浸蟲法：取20 mL已配好的白僵菌孢子懸浮液，挑選大小相近的健康家蠶，將其浸入孢子懸浮液中約5 s，取出后用濾紙吸干蠶體上多余的液體，放到直徑15 cm的培養(yǎng)皿中用新鮮桑葉喂養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃，相對濕度為90%。每處理設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)20頭蠶。對照用0.1%吐溫-80無菌水代替孢子懸浮液。

浸葉片法：取孢子懸浮液40 mL，選取新鮮、大小相近的桑葉，浸入孢子懸浮液中，使整個葉片都充分潤濕后取出，置于白磁盤中自然晾干后用于喂養(yǎng)健康家蠶，讓蠶取食24 h后換未經(jīng)處理的新鮮桑葉飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃，相對濕度為90%。每處理設(shè)3個重復(fù)，每重復(fù)20頭蠶。對照用0.1%吐溫-80無菌水代替孢子懸浮液。

1.2.3 白僵菌孢子萌發(fā)率的測定 采用凹玻片法測定白僵菌孢子的萌發(fā)率[9]。將白僵菌孢子懸浮液滴加在潔凈凹玻片的凹槽處，置于溫度（25±1）℃、相對濕度 90%的條件下培養(yǎng)，分別于不同時間用顯微鏡觀察孢子萌發(fā)情況，以可見芽管長度大于孢子長度1/2作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。每處理重復(fù)3次，每重復(fù)隨機(jī)檢查5個視野，鏡檢孢子總數(shù)不少于200個，計算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 人工紫外光照射對白僵菌孢子萌發(fā)及致病力的影響

2.1.1 人工紫外光照射對白僵菌孢子萌發(fā)的影響 用紫外燈（功率20 W，照射距離20 cm）分別照射白僵菌孢子懸浮液1、3和6 h，然后采用凹玻片法測定孢子萌發(fā)率，結(jié)果見表1。由表1可見，人工紫外光對孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用，經(jīng)人工紫外光照射后孢子的萌發(fā)率明顯降低，人工紫外光照射1、3和6 h后白僵菌孢子72 h的萌發(fā)率分別為10.250%、2.730%和0.490%，而對照萌發(fā)率均為100.000%。

2.1.2 人工紫外光照射對白僵菌孢子懸浮液致病力的影響 用紫外燈（20 W，照射距離20 cm）分別照射白僵菌孢子懸浮液和白僵菌原粉不同時間，然后測定它們對2齡家蠶的致病能力，結(jié)果見表2和表3。由表2可知，用人工紫外光照射1、3和6 h后，白僵菌孢子懸浮液對家蠶的致死率分別為6.67%、10.00%和6.67%，與未經(jīng)人工紫外光照射的孢子相比致病能力明顯下降。由表3可知，人工紫外光照射對白僵菌原粉的致病力影響小，照射24 h后其對家蠶的致死率仍達(dá)93.33%，與對照相比致死率稍有下降。

2.2 自然光照射對白僵菌致病力的影響

2.2.1 白僵菌孢子懸浮液噴桑葉經(jīng)自然光照射后的致病力 在室外用白僵菌孢子懸浮液（濃度為1×108個/mL）噴灑桑葉，分別于0、3、6、12、24、36 h采集處理過的桑葉飼喂2齡家蠶，測定白僵菌孢子的致病力，結(jié)果見表4。由表4可知，將白僵菌孢子懸浮液噴至桑葉后，隨光照時間的增加，白僵菌孢子的致病力降低，自然光照射3、6、12、24、36 h后，對家蠶的致死率分別為100.00%、70.00%、79.66%、10.00%和25.00%。

2.2.2 白僵菌原粉噴桑葉經(jīng)自然光照射后的致病力 用白僵菌原粉噴灑桑葉，分別于0、6、12、24、30、36、48、54、78 h采集處理過的桑葉飼喂2齡家蠶，測定白僵菌原粉對家蠶的致病力，結(jié)果見表5。由表5可知，采用白僵菌殺蟲劑原粉噴桑葉，經(jīng)自然光照射0～36 h后，對家蠶的致死率為88.33%～96.67%；48 h后對家蠶的致死率大幅度下降，照射48、54、78 h后對家蠶的致死率分別為53.33%、31.67%和23.33%。可見隨著自然光照射時間的增加，桑葉上白僵菌原粉對家蠶的致死率呈下降趨勢。

2.2.3 白僵菌原粉噴蠶體經(jīng)自然光照射后的致病力 直接將白僵菌原粉置于自然光下照射，分別于0、6、12、24、30、36、48、54 h取白僵菌原粉采用噴蠶體法處理2齡家蠶，測定白僵菌原粉經(jīng)不同時間自然光照射后的致病力，結(jié)果見表6。由表6可知，直接置于自然光下照射的白僵菌原粉隨光照時間增加對家蠶的致病力下降，30 h后致病力下降明顯。

2.3 漂白粉對白僵菌孢子萌發(fā)及致病力的影響

2.3.1 漂白粉對白僵菌孢子萌發(fā)的影響 采用硫代硫酸鈉滴定法測定漂白粉溶液中的有效氯濃度，并配制有效氯為0.30%、1.00%和2.00% 3個不同濃度的漂白粉溶液，采用凹玻片法測定不同濃度漂白粉溶液對白僵菌孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果見表7。由表7可知，有效氯濃度為1.00%和2.00%的漂白粉溶液對白僵菌孢子萌發(fā)有很強(qiáng)的抑制作用，72 h孢子萌發(fā)率分別為1.000%和0；而有效氯濃度為0.30%的漂白粉溶液對白僵菌孢子萌發(fā)無影響，48 h萌發(fā)率即可達(dá)到100.000%。

2.3.2 漂白粉對白僵菌致病力的影響 先用白僵菌孢子懸浮液浸蠶體或噴桑葉，干后再用不同濃度的漂白粉溶液噴蠶體或桑葉進(jìn)行消毒處理，測定漂白粉對白僵菌孢子致病力的影響，結(jié)果見表8。由表8可見，用有效氯濃度為2.00%的漂白粉溶液消毒葉片比消毒蠶體的效果好，噴桑葉和噴蠶體消毒處理后，2齡家蠶的死亡率分別為5.00%和60.00%。

2.4 漂白粉對白僵菌原粉致病力的影響

先用白僵菌原粉噴粉處理蠶體和桑葉，再分別用有效氯濃度為2.00%、0.40%和0.08%的漂白粉溶液對蠶體或桑葉進(jìn)行消毒處理，測定漂白粉對白僵菌原粉致病力的影響，結(jié)果見表9。由表9可知，用2.00%漂白粉溶液消毒桑葉的效果最好，2齡家蠶死亡率為0，用0.40%和0.08%漂白粉溶液消毒桑葉效果較差，2齡家蠶死亡率分別為71.67%和98.33%；用2.00%漂白粉溶液消毒蠶體有一定的效果，家蠶死亡率為31.67%，而用0.40%和0.08%的漂白粉溶液消毒蠶體沒有效果，家蠶死亡率均為100.00%。總體來看，桑葉消毒效果較蠶體消毒效果好。

3 小結(jié)與討論

白僵菌雖然對家蠶造成危害，但它又是一種優(yōu)良的微生物殺蟲劑，在農(nóng)林害蟲防治上發(fā)揮了重要作用，特別是在林業(yè)松毛蟲防治方面有優(yōu)良效果，因而被大量推廣應(yīng)用[10，11]。白僵菌孢子與昆蟲體壁接觸或被食入蟲體內(nèi)，會使昆蟲感染發(fā)生白僵病而死亡。病死后的蟲體會長出白色菌絲和大量的分生孢子，分生孢子隨風(fēng)飄散，又會使其他昆蟲感染發(fā)病[12]。因此，白僵菌可在林區(qū)較長時間內(nèi)控制防治對象的蟲口密度，但同時也會對其他有益昆蟲造成長期危害。廣西是松毛蟲多發(fā)地區(qū)，全區(qū)平均年發(fā)生面積超過2萬hm2，嚴(yán)重威脅著森林資源的安全。廣西推廣使用白僵菌微生物殺蟲劑防治松毛蟲，能有效控制松毛蟲的成災(zāi)及危害[13]。然而，這些白僵菌釋放到環(huán)境中，隨著白僵菌分生孢子的增加和擴(kuò)散以及在施藥過程中造成的直接污染，是否會在釋放區(qū)域?qū)倚Q等經(jīng)濟(jì)類昆蟲造成嚴(yán)重威脅，這也是一個被普遍關(guān)注的問題。通過此次試驗研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌原粉和從原粉中分離培養(yǎng)的孢子不論以何種方式與家蠶接觸，均能使家蠶感染白僵病而死亡。人工紫外光和自然光照射以及漂白粉溶液對白僵菌有殺傷作用。根據(jù)這些研究結(jié)果，對家蠶白僵病的防治可采取以下措施：

1）在種桑養(yǎng)蠶區(qū)噴施白僵菌原粉時，不能將原粉噴灑到桑葉上或蠶室內(nèi)或蠶體上，桑葉被白僵菌原粉污染后喂蠶或蠶體上污染白僵菌原粉均容易引發(fā)家蠶白僵病。如果桑葉不慎被白僵菌原粉污染了，在短期內(nèi)不能采摘被污染的桑葉喂蠶，必須等到白僵菌原粉在連續(xù)幾天的自然光照射下失去致病力后或被大雨沖掉后才能采桑葉喂蠶。

2）從田間采回喂蠶的桑葉可用含有效氯2.00%的漂白粉溶液消毒，殺死桑葉上附著的白僵菌孢子，待桑葉晾干后再喂蠶。

3）平時注意蠶具的清潔和消毒，蠶具可用含有效氯2.00%的漂白粉溶液消毒，也可用紫外燈照射6 h以上來殺死蠶具上的白僵菌孢子。蠶室不定期地用紫外燈照射或噴灑漂白粉溶液消毒，但蠶室有蠶時不能用紫外燈照射。

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