魚類生長(zhǎng)激素釋放肽及其受體的研究進(jìn)展

摘要：生長(zhǎng)激素釋放肽（Ghrelin）是生長(zhǎng)激素促分泌素受體（Growth hormone secretagogue receptor， GHS-R）的一種內(nèi)源性配體，主要在胃腸道內(nèi)產(chǎn)生。目前不少魚類的Ghrelin基因和氨基酸序列已經(jīng)確定。魚類Ghrelin能促進(jìn)生長(zhǎng)激素（GH）、促黃體釋放激素（LH）的分泌，并參與攝食調(diào)節(jié)，表明Ghrelin是一種具有多種生理活性的多肽。綜述了魚類Ghrelin及其受體的結(jié)構(gòu)和分布，并對(duì)其調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹，最后論述了Ghrelin在魚類中的生理功能，旨在為Ghrelin在魚類營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)及內(nèi)分泌生理學(xué)中的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：魚類；生長(zhǎng)激素釋放肽（Ghrelin）；受體；結(jié)構(gòu)與組織分布；生理功能

中圖分類號(hào)：Q175；S917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）03-0497-05

生長(zhǎng)激素釋放肽（Ghrelin）是Kojima等[1]在鼠（Mus musculus）胃中分離出的一種腦腸肽，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體（Growth hormone secretagogue receptor，GHS-R）的內(nèi)源性配體。在哺乳動(dòng)物中，Ghrelin主要在胃中產(chǎn)生，是繼生長(zhǎng)激素釋放激素（Growth hormone releasing hormone， GHRH）和生長(zhǎng)抑素（Somatostatin， SRIF）后發(fā)現(xiàn)的第三種調(diào)節(jié)生長(zhǎng)激素（Growth hormone， GH）分泌的多肽[2]。近年來，隨著對(duì)Ghrelin研究的增多，人們發(fā)現(xiàn)Ghrelin還具有調(diào)節(jié)動(dòng)物攝食、生長(zhǎng)和脂肪沉積的功能，在合成代謝中具有重要作用[3]。國(guó)內(nèi)外對(duì)魚類Ghrelin的研究主要集中在其基因的克隆及組織表達(dá)方面，也涉及到外源性Ghrelin對(duì)機(jī)體激素分泌及攝食功能的影響等方面。本文對(duì)近年來國(guó)內(nèi)外魚類Ghrelin及其受體的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了概括性綜述，旨在進(jìn)一步促進(jìn)魚類Ghrelin研究，為其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 Ghrelin的結(jié)構(gòu)與組織分布

Kojima等[1]從鼠胃中分離提純的成熟Ghrelin含有28個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約為3 300，N端第三位絲氨酸具有辛酰基化結(jié)構(gòu)，與人的Ghrelin同源性較高，只有2個(gè)氨基酸差異。隨后又在鼠胃中發(fā)現(xiàn)了另一種含有27個(gè)氨基酸殘基的Ghrelin，其在第14位上少一個(gè)谷氨酸[4]。鼠Ghrelin基因含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，而金魚（Carassius auratus）Ghrelin基因序列只有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子[5]。成熟Ghrelin主要有兩種分子存在形式，即第三位絲氨酸殘基N端辛酰基化和去N端辛酰基化，N端辛酰基化對(duì)其生物活性具有重要作用，而去N端辛酰基化Ghrelin的生理功能還不是很清楚[1]。

在人（Homo sapiens）、鼠和牛蛙（Rana catesbeiana）中已經(jīng)克隆出了Ghrelin的cDNA序列，Unniappan等[5]首次在魚類中克隆獲得金魚Ghrelin前體的cDNA序列，推測(cè)其編碼103個(gè)氨基酸，包括含26個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，19個(gè)氨基酸的成熟肽和C端的55個(gè)氨基酸。隨后斑馬魚（Danio rerio）[6]、莫桑比克羅非魚（Oreochromis mossambicus）[7]、斑點(diǎn)叉尾（Ictalurus punctatus）[8]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[9]等魚類的Ghrelin也相繼被克隆出來。Miura等[10]進(jìn)一步從金魚的腸道中分離出了含有14、17、18和19個(gè)氨基酸殘基的Ghrelin，它們?cè)诘谌话被嵘弦簿哂行刘；Y(jié)構(gòu)，其中以含17個(gè)氨基酸殘基的Ghrelin為主。

Ghrelin屬于一種胃腸道類多肽，主要在胃中產(chǎn)生，由胃黏膜組織中的X/A樣細(xì)胞分泌[11]。通過免疫組織化學(xué)反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Ghrelin在鼠腦弓狀核中存在，隨后發(fā)現(xiàn)其在雞（Gallus domesticus）、巴西龜（Trachemys scripta elegans）和蛙胃中也存在[1，12-14]。在魚類中，雌性與雄性虹鱒的胃中都存在Ghrelin免疫反應(yīng)，也發(fā)現(xiàn)了X/A樣細(xì)胞的存在[15]。最近，Olsson等[16]報(bào)道斑馬魚腸道中也有Ghrelin免疫反應(yīng)細(xì)胞存在。這說明哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物和魚類的胃和腸道都廣泛存在Ghrelin。

對(duì)Ghrelin mRNA的組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，Ghrelin主要表達(dá)于脊椎動(dòng)物的胃腸道中，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其他外周組織中也有表達(dá)。Kojima等[1]首先檢測(cè)到Ghrelin mRNA在鼠胃中有表達(dá)，隨后Date等[17]發(fā)現(xiàn)Ghrelin mRNA在鼠的腸道、胰臟、肝臟、心臟、肺、白色脂肪組織、下丘腦、垂體和前腦中葉也存在。在魚類中，通過RT-PCR和Southern blot分析，首次在金魚的端腦、下丘腦、腸道、脾臟和鰓中檢測(cè)到Ghrelin mRNA的存在，而采用Northern blot方法檢測(cè)則發(fā)現(xiàn)其只在腸道中表達(dá)，這說明在無胃魚類中，腸道是其主要的表達(dá)部位[5]。Kaiya等[7]研究表明，莫桑比克羅非魚Ghrelin mRNA在胃中具有較高的表達(dá)水平，而在腦、腎臟和鰓中的表達(dá)量較低。進(jìn)一步利用RT-PCR的方法對(duì)虹鱒Ghrelin mRNA組織表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，也發(fā)現(xiàn)其在胃中具有很高的表達(dá)水平，在腦、下丘腦和腸道中的表達(dá)居于中等水平[9]。Parhar等[18]研究發(fā)現(xiàn)尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）Ghrelin mRNA只在胃中表達(dá)，而在腦、垂體、心臟和腎臟中沒有表達(dá)。上述研究表明，不同的魚類中Ghrelin mRNA表達(dá)具有物種特異性，但主要在胃腸道中表達(dá)，表明Ghrelin與魚類的消化及攝食調(diào)控功能有關(guān)。

2 Ghrelin受體的結(jié)構(gòu)與組織分布

Ghrelin的受體GHS-R有1a和1b兩種亞型，其中GHS-R 1a有7個(gè)跨膜域，而GHS-R 1b僅含有5個(gè)跨膜域[19]。GHS-R是一種視紫紅質(zhì)樣物質(zhì)，為典型的G蛋白偶聯(lián)受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員[20]。少量GHS-R與Ghrelin結(jié)合后即可促進(jìn)GH的分泌，在內(nèi)分泌學(xué)中具有重要的調(diào)節(jié)功能。與哺乳動(dòng)物一樣，魚類的GHS-R基因包含2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。Palyha等[21]首先在河豚（Spheroides nephelus）中分離到了GHS-R基因，它與人的GHS-R序列具有58%的同源性。Chan等[22]發(fā)現(xiàn)在黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）中，由于GHS-R基因在不同位點(diǎn)的剪切，形成兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（GHS-R1a和GHS-R1b），且GHS-R1a與哺乳動(dòng)物的同源性較低；在共同表達(dá)的情況下，GHS-R 1b會(huì)減弱GHS-R 1a的功能活性，但具體作用方式還不太清楚。

GHS-R在動(dòng)物不同組織中的分布也具有明顯差異。在哺乳動(dòng)物中，GHS-R主要分布在垂體和下丘腦中，外周組織中含量較少。Kaiya等[23]采用RT-PCR方法，發(fā)現(xiàn)虹鱒的兩種GHS-R mRNA也主要在垂體和下丘腦表達(dá)，其他組織中的表達(dá)量較低。Chan等[22]通過放射性PCR方法發(fā)現(xiàn)黑鯛GHS-R1a主要在垂體中表達(dá)，而GHS-R1b主要在端腦中表達(dá)。利用半定量RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）GHS-R1a mRNA主要在腦和垂體中表達(dá)，以垂體和下丘腦中最高；而GHS-R1b mRNA則廣泛分布于腦和外周組織[24]。魚類GHS-R mRNA集中分布在垂體和下丘腦中，可能與Ghrelin需要通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)來發(fā)揮其生理功能有關(guān)。

3 Ghrelin的作用機(jī)制

目前，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ghrelin具有多種生理功能，但對(duì)于其作用機(jī)制尚不清楚。研究表明，在促進(jìn)生長(zhǎng)激素分泌的過程中，當(dāng)Ghrelin與其受體結(jié)合后可激活磷酸酯酶，磷酸酯酶水解細(xì)胞膜內(nèi)二磷酸脂酰肌醇，使之生成三磷酸肌醇和甘油二酯，然后三磷酸肌醇促使鈣從鈣庫中釋放出來，甘油二酯作用于蛋白激酶，打開細(xì)胞膜上的鈣離子通道，使細(xì)胞外的鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的上升刺激生長(zhǎng)激素的分泌[25]。也有研究認(rèn)為，Ghrelin是通過對(duì)下丘腦進(jìn)行調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)其功能的，因?yàn)橄虑鹉X弓狀核上存在Ghrelin的神經(jīng)元。Date等[26]研究了Ghrelin對(duì)鼠GH分泌及GH mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)注射Ghrelin后血液中GH含量升高，而GH mRNA與對(duì)照組沒有顯著差異，認(rèn)為Ghrelin只是促進(jìn)了GH的分泌，并未提高GH mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。但是，Unniappan等[27]在體外用Ghrelin孵育金魚腦垂體時(shí)發(fā)現(xiàn)其不僅能增加GH的分泌，同時(shí)也能促進(jìn)GH mRNA表達(dá)量的上升，認(rèn)為Ghrelin對(duì)GH的合成和分泌作用在不同種類之間也可能存在一定的差異。

4 魚類Ghrelin的生理功能

已有研究表明Ghrelin是一種多肽，具有多種生理功能。對(duì)Ghrelin的早期研究集中在其對(duì)哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)上，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)垂體生長(zhǎng)激素的分泌、調(diào)節(jié)動(dòng)物攝食、促進(jìn)胃腸道運(yùn)動(dòng)等功能。對(duì)魚類Ghrelin的研究也發(fā)現(xiàn)其具有類似的功能。

4.1 促進(jìn)GH分泌的功能

最初從鼠胃中提取和分離出Ghrelin后，Kojima等[1]就發(fā)現(xiàn)辛酰基化的Ghrelin無論在體外還是體內(nèi)都能促進(jìn)GH的分泌。此后，在人、豬（Sus scrofa）、牛（Bos taurus）等哺乳動(dòng)物的研究中也發(fā)現(xiàn)Ghrelin能促進(jìn)GH的釋放。在GH分泌的調(diào)節(jié)中，除眾所周知的下丘腦分泌的GHRH可促進(jìn)GH分泌外，Brazeau等[28]在1973年又從綿羊（Ovis aries）下丘腦中分離得到SRIF，發(fā)現(xiàn)其可以抑制垂體GH分泌。Ghrelin是迄今發(fā)現(xiàn)的第三種調(diào)節(jié)GH分泌的激素，使人類對(duì)GH的調(diào)節(jié)機(jī)制得到更深入的認(rèn)識(shí)。

在Ghrelin對(duì)魚類GH分泌的調(diào)節(jié)研究方面，Riley等[29]首先發(fā)現(xiàn)用鼠中提取的Ghrelin孵育莫桑比克羅非魚的離體腦垂體可以刺激GH的釋放。Ran等[30]研究發(fā)現(xiàn)鼠Ghrelin在10-7 mol/L孵育斜帶石斑魚離體腦垂體6 h后可以顯著提高GH和GH mRNA水平，說明Ghrelin不僅能夠促進(jìn)GH的分泌，而且能夠促進(jìn)其合成。以上研究表明，用外源性Ghrelin孵育魚類離體腦垂體能刺激GH的分泌，這可能與Ghrelin結(jié)構(gòu)的保守性有關(guān)。Kaiya等[7]在提取了莫桑比克羅非魚的Ghrelin后，在不同濃度下對(duì)離體腦垂體進(jìn)行不同時(shí)間的孵育，發(fā)現(xiàn)Ghrelin在10 nmol/L濃度下能夠顯著刺激GH的釋放。

Kaiya等[9]在對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰腹腔注射Ghrelin 1 h后，其血漿GH水平明顯升高，但2 h后又恢復(fù)到正常水平。Unniappan等[27]在金魚腹腔注射Ghrelin 15～30 min后即發(fā)現(xiàn)金魚血清GH水平明顯上升，隨后又減少，說明腹腔注射Ghrelin能在短時(shí)間內(nèi)迅速促進(jìn)GH的分泌，胃腸道內(nèi)可能存在Ghrelin的作用靶位。也有研究表明，Ghrelin的類似物也能促進(jìn)GH的分泌，對(duì)莫桑比克羅非魚腹腔注射人工合成的Ghrelin類似物KP-102（注射量為1 ng/g和10 ng/g），6 h后血漿GH水平明顯升高[31]。由于魚類的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也存在Ghrelin的受體，所以在魚類側(cè)腦室注射Ghrelin后也能促進(jìn)GH的分泌。Unniappan等[27]在金魚側(cè)腦室注射1 ng/g Ghrelin后，能明顯促進(jìn)GH的分泌，說明Ghrelin可以通過下丘腦-垂體軸來調(diào)節(jié)GH的分泌。

4.2 促進(jìn)LH分泌的作用

促黃體生成激素（Luteinizing hormone，LH）是促性腺激素的一種，它作用于成熟的卵泡，引起排卵并生成黃體，也可促進(jìn)雄性激素的分泌，在動(dòng)物的生殖過程中具有重要作用。目前，Ghrelin對(duì)LH的作用機(jī)理還不是很清楚。Kojima等[1]最先報(bào)道Ghrelin對(duì)鼠垂體LH的分泌沒有影響，而Fernandez等[32]發(fā)現(xiàn)Ghrelin孵育鼠離體腦垂體可以抑制LH的分泌。最近在研究Ghrelin對(duì)魚類LH的分泌作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)10-6 mol/L的Ghrelin孵育雌性鯉（Cyprinus carpio）的離體腦垂體可明顯促進(jìn)LH的分泌，并發(fā)現(xiàn)Ghrelin是通過刺激生殖細(xì)胞而發(fā)揮作用的，與促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）具有協(xié)同作用[33]。上述研究都是通過離體孵育試驗(yàn)得到的結(jié)論，Unniappan等[27]發(fā)現(xiàn)無論是在離體孵育還是腹腔或側(cè)腦室注射條件下，Ghrelin都可以在短時(shí)間內(nèi)促進(jìn)金魚血清LH水平上升，在一定程度上證明了Ghrelin對(duì)魚類LH分泌具有促進(jìn)作用。

4.3 攝食調(diào)節(jié)的功能

在脊椎動(dòng)物中，攝食調(diào)節(jié)主要是通過食欲刺激因子與抑制因子來發(fā)揮作用，這些食欲因子來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)或外周組織。在魚類中較早發(fā)現(xiàn)的食欲調(diào)節(jié)因子主要有神經(jīng)肽Y（NPY）、食欲素、甘丙肽、促腎上腺皮質(zhì)激素（CRH）、縮膽囊肽（CCK）、胃泌素釋放肽（GRP）及鈴蟾肽等[34]。

Ghrelin是新近發(fā)現(xiàn)的一種可以調(diào)節(jié)攝食的胃腸道分泌的多肽。Matthias等[35]對(duì)小鼠側(cè)腦室注射人工合成的鼠Ghrelin，可以增加小鼠的攝食能力和體重，且存在劑量依賴性。人類血清中Ghrelin含量在餐前升高，餐后降低，進(jìn)一步證明了Ghrelin與攝食調(diào)控有關(guān)[36]。然而，在研究Ghrelin對(duì)雞的攝食調(diào)節(jié)作用時(shí)，雛雞腦室注射Ghrelin后可抑制雞的攝食，并存在劑量依賴性[37]。這些研究說明在不同種類中，Ghrelin的攝食調(diào)節(jié)作用存在一定的差異。

在魚類中Ghrelin也具有促進(jìn)攝食的功能。Riley等[38]通過對(duì)莫桑比克羅非魚體內(nèi)埋置Ghrelin-C10，可以明顯提高其攝食能力，增加體重，不過對(duì)體長(zhǎng)沒有顯著影響。虹鱒腹腔注射Ghrelin也可以顯著提高其攝食率[39]。Miura等[40]對(duì)金魚側(cè)腦室注射1 pmol/g Ghrelin 15 min后可明顯促進(jìn)金魚攝食，且1 h內(nèi)其攝食能力沒有減退，說明側(cè)腦室注射對(duì)攝食的調(diào)節(jié)比較明顯，腦中可能存在與調(diào)節(jié)食欲有關(guān)的受體。Unniappan等[5]對(duì)金魚側(cè)腦室注射己辛酰基化的金魚Ghrelin-19也發(fā)現(xiàn)了類似的效果。

研究表明，魚類機(jī)體處于負(fù)能量平衡時(shí)會(huì)上調(diào)Ghrelin mRNA的水平，而處于正能量平衡時(shí)會(huì)下調(diào)Ghrelin mRNA水平，其中研究較多的是攝食和饑餓對(duì)Ghrelin表達(dá)的影響。Terova等[41]研究饑餓及再投喂對(duì)海鱸（Dicentrarchus labrax）胃組織Ghrelin mRNA水平的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)饑餓4 d后沒有產(chǎn)生顯著影響，而饑餓35 d后Ghrelin mRNA水平顯著升高，即便隨后再投喂4 d，其仍處于較高水平。Unniappan等[5]發(fā)現(xiàn)饑餓7 d后，金魚腸道組織Ghrelin mRNA的表達(dá)量顯著增加，而血清Ghrelin水平早在饑餓第三天就已經(jīng)顯著升高；恢復(fù)攝食后，腸道Ghrelin mRNA水平和血清Ghrelin水平降低。莫桑比克羅非魚攝食前后腦和胃組織中Ghrelin mRNA水平都呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，說明Ghrelin在攝食調(diào)節(jié)中發(fā)揮了一定的作用[42]。

4.4 其他生理功能

在哺乳動(dòng)物中，Ghrelin在調(diào)節(jié)免疫功能中能起到一定的作用。Dixit等[43]發(fā)現(xiàn)Ghrelin可以抑制人T細(xì)胞和單核細(xì)胞中促炎癥因子的表達(dá)。在魚類中，Yada等[44]發(fā)現(xiàn)Ghrelin可以增強(qiáng)虹鱒白細(xì)胞的吞噬活性，并促進(jìn)超氧化物的生成。Kono等[45]發(fā)現(xiàn)鯉魚脾臟細(xì)胞在體外經(jīng)脂多糖、植物凝集素和咪喹莫特刺激后，Ghrelin mRNA的表達(dá)量上升。Ghrelin與魚類的生長(zhǎng)也有密切聯(lián)系。在尼羅羅非魚的“快速生長(zhǎng)期”之前Ghrelin mRNA的表達(dá)量增加，Ghrelin還可以影響莫桑比克羅非魚和虹鱒胰島素樣生長(zhǎng)因子的釋放[18，46]。Kozaka等[47]研究表明，顱內(nèi)注射Ghrelin還可以抑制日本鰻鱺（Anguilla japonica）的攝食行為。

5 魚類Ghrelin研究及其在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用展望

自十多年前發(fā)現(xiàn)Ghrelin以來，許多研究表明Ghrelin在哺乳動(dòng)物的內(nèi)分泌、神經(jīng)、消化、循環(huán)和免疫等方面具有多種功能。在魚類中，雖然國(guó)內(nèi)外已經(jīng)克隆出多種魚類Ghrelin基因，發(fā)現(xiàn)Ghrelin在促進(jìn)魚類攝食、生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)激素分泌及糖和脂肪代謝方面具有一定的功能，但與哺乳動(dòng)物相比，在很多方面的研究仍比較滯后。下一步對(duì)魚類Ghrelin的研究應(yīng)著眼于探索其在促進(jìn)生長(zhǎng)、免疫調(diào)控及繁殖發(fā)育等方面的功能和調(diào)控作用機(jī)制，為Ghrelin在魚類養(yǎng)殖生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

目前，中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界首位，并呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在國(guó)計(jì)民生方面產(chǎn)生了非常重要的影響。如果能將水產(chǎn)學(xué)相關(guān)理論和研究成果應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)當(dāng)中，將會(huì)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。首先，由于Ghrelin屬于一種上游激素，只需要很少的量即可產(chǎn)生明顯效果，而且Ghrelin的肽鏈比較短，可以被胃腸道直接吸收，因此，如能采取合理的方式將Ghrelin作為飼料添加劑加入飼料中，必將對(duì)加快魚類生長(zhǎng)、提高養(yǎng)殖產(chǎn)量等產(chǎn)生積極影響。其次，在魚類Ghrelin的分泌調(diào)控方面，如能通過一定的方式誘導(dǎo)體內(nèi)Ghrelin基因的表達(dá)，也可能產(chǎn)生較好的促生長(zhǎng)效果。當(dāng)然，這都有待于對(duì)魚類Ghrelin的結(jié)構(gòu)及其在內(nèi)分泌系統(tǒng)中的作用和調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入研究和探索。

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