紫菜葉綠素銅鈉鹽的制備及其穩(wěn)定性研究

摘要：以紫菜為主要原料制備葉綠素銅鈉鹽，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)等優(yōu)化葉綠素銅代反應(yīng)條件及皂化條件，并對紫菜葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，紫菜葉綠素銅鈉鹽制備的最佳工藝條件為葉綠素銅化時(shí)間12 h、浸提溫度50 ℃、浸提時(shí)間2 h，丙酮與乙醇體積比6∶4的混合液作浸提液溶劑，液料比V溶劑∶m紫菜=60∶1 （mL/g）；皂化溫度60 ℃、皂化時(shí)間40 min以上、皂化液pH 11.51～11.93。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明紫菜葉綠素銅鈉鹽耐光性較差，在室溫、pH 8～12時(shí)穩(wěn)定性較好，高于80 ℃的溫度和強(qiáng)酸強(qiáng)堿會導(dǎo)致紫菜葉綠素銅鈉鹽變性，食鹽、白砂糖、淀粉等常見食品添加劑對其無不良影響。

關(guān)鍵詞：紫菜；葉綠素銅鈉鹽；制備；穩(wěn)定性

中圖分類號：TS264.4；S985.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0639-06

葉綠素是常用的天然色素之一[1]，除被廣泛用作食品、化妝品的著色劑與脫臭劑外，還因其具有抗誘變、抗氧化等活性[2]，在醫(yī)藥上可被用來治療傳染性肝炎、胃及十二指腸潰瘍、慢性腎炎及急性胰腺炎，增進(jìn)造血機(jī)能及促進(jìn)放射線損害機(jī)體的康復(fù)[3-7]。生活在海洋中的藻類由于水中可被利用的光能比陸地上少得多，要完成能量的轉(zhuǎn)移必須增加參與光合作用的葉綠素的含量[8]，所以海洋植物中葉綠素含量常常高于陸生植物。從理論上來說利用海洋植物來提取葉綠素，可以獲得較高的提取效率。由于天然葉綠素遇熱、光、酸、堿等易分解，且不溶于水，故不易保存，應(yīng)用受限。近年來對天然葉綠素進(jìn)行改性使其變成穩(wěn)定的金屬卟啉結(jié)構(gòu)倍受關(guān)注，改性后的葉綠素銅鈉鹽是其金屬卟啉結(jié)構(gòu)中最重要的種類之一，基本原理是葉綠素分子中的Mg在酸性條件下被Cu取代，生成葉綠素銅代鹽，葉綠素銅代鹽在堿性條件下經(jīng)過皂化生成葉綠素銅鈉鹽。葉綠素銅鈉鹽具有很高的穩(wěn)定性，是一種安全無毒、水溶性好的天然食用色素[3]，除具有葉綠素的用途外，還可作光電轉(zhuǎn)換材料等[9]。

本研究以紫菜為主要原料，以丙酮—乙醇混合溶劑為提取劑，采用溶劑浸提法提取葉綠素[10]，制備葉綠素銅鈉鹽，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行研究，以期為海洋資源的綜合利用和天然葉綠素產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫菜購于福建省廈門市集美區(qū)石鼓路菜市場。主要試劑硫酸銅、氫氧化鈉、鹽酸、乙醇、丙酮、硫酸銅晶體（CuSO4·5H2O）均為分析純；食鹽、白砂糖、淀粉均為食品級。

主要儀器與設(shè)備有723PC紫外可見分光光度計(jì)（美國BECKMAN公司）、pH 211酸度計(jì)（北京哈納科儀科技有限公司）、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）、DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）、FA1004電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）、KQ5200D數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、FW100高速萬能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫菜葉綠素銅鈉鹽的制備方法 稱取2.0 g紫菜于試管中，用50 g/L CuSO4溶液（pH 3.51）銅化12 h后洗滌脫水于錐形瓶中，加入丙酮—乙醇混合液（V丙酮∶V乙醇=6∶4）120 mL，在室溫下浸提2 h，過濾得紫菜葉綠素銅代鹽的浸提液。浸提液濃縮后加入50 g/L氫氧化鈉溶液，調(diào)pH為11.51～11.93，在60 ℃水浴鍋中加熱回流皂化40 min以上，用石油醚萃取后靜置分層，將萃取后的葉綠素銅鈉鹽于水浴鍋中濃縮成鹽，干燥后得到墨綠色帶金屬光澤的葉綠素銅鈉鹽。

葉綠素銅鈉鹽得率=紫菜葉綠素銅鈉鹽粗產(chǎn)品質(zhì)量/紫菜質(zhì)量×100%

1.2.2 紫菜葉綠素銅代鹽和銅鈉鹽吸收光譜圖的繪制 ①紫菜葉綠素銅代鹽的吸收光譜圖。用移液槍吸取1 mL紫菜葉綠素銅代鹽浸提液于10 mL的容量瓶中，用丙酮—乙醇混合溶劑（V丙酮∶V乙醇=6∶4）稀釋至刻度，并以此溶劑作參比，用紫外可見分光光度計(jì)在360～680 nm波長范圍內(nèi)掃描。②紫菜葉綠素銅鈉鹽的吸收光譜圖。取葉綠素銅鈉鹽粗品0.1 g加蒸餾水溶解，移入100 mL容量瓶中用蒸餾水定容，再分別取1、2、3 mL用蒸餾水定容于10 mL容量瓶中，以蒸餾水作參比，用紫外可見分光光度計(jì)在360～680 nm波長范圍內(nèi)掃描。

1.2.3 紫菜葉綠素銅代鹽制備條件的優(yōu)化 ①浸提溶劑。分別以95%乙醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）、95%丙酮、95%甲醇、丙酮—乙醇混合液（V丙酮∶V乙醇=95∶5）為浸提溶劑，按試驗(yàn)方法制備紫菜葉綠素銅代鹽浸提液。②浸提溶劑丙酮—乙醇混合液體積比。分別按V丙酮∶V乙醇=1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1配制丙酮—乙醇混合液作為浸提溶劑，制備紫菜葉綠素銅代鹽浸提液。③銅化時(shí)間。銅化時(shí)間分別為9、10、11、12、13、14 h，按試驗(yàn)方法制備紫菜葉綠素銅代鹽浸提液。④銅化液pH。銅化液pH分別為2.02、2.52、3.06、3.51，其中3.51為未加酸銅化液的pH，按試驗(yàn)方法制備紫菜葉綠素銅代鹽浸提液。⑤浸提時(shí)間。浸提時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，按試驗(yàn)方法制備紫菜葉綠素銅代鹽浸提液。⑥液料比（V溶劑∶m紫菜，mL/g，下同）。分別按V溶劑∶m紫菜=30∶l、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1添加溶劑，按試驗(yàn)方法制備紫菜葉綠素銅代鹽浸提液。⑦浸提溫度。分別在25（室溫）、30、35、40、45、50、55 ℃的浸提溫度下按試驗(yàn)方法制備紫菜葉綠素銅代鹽浸提液。⑧正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素研究結(jié)果，選擇對葉綠素銅代鹽制備影響較大的因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化葉綠素銅化條件。

1.2.4 紫菜葉綠素銅鈉鹽皂化條件的優(yōu)化 ①溫度和時(shí)間對葉綠素銅鈉鹽皂化效果的影響。調(diào)濾液pH為11.85，在60 ℃和70 ℃下皂化不同時(shí)間（20、40、60、80、100 min），用石油醚萃取未被皂化的物質(zhì)，觀察萃取液和濃縮液的顏色和分層情況。②pH對葉綠素銅鈉鹽皂化效果的影響。將濃縮液用NaOH溶液調(diào)至不同的pH，在60 ℃下皂化40 min，用石油醚萃取不皂化物質(zhì)，觀察分層情況和石油醚層的顏色。

1.2.5 紫菜葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性研究 取制備的葉綠素銅鈉鹽0.1 g用蒸餾水定容至1 L，配成0.1g/L的溶液，分別測定其在不同光照、pH、溫度和添加食品添加劑條件下的穩(wěn)定性。①紫菜葉綠素銅鈉鹽的耐光性。取葉綠素銅鈉鹽溶液，分別在暗處與可見光下保存，每隔2 h測A405.1 nm。②紫菜葉綠素銅鈉鹽在不同pH下的穩(wěn)定性。取葉綠素銅鈉鹽溶液，用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)成不同的pH，靜置2 h后測定A405.1 nm。③紫菜葉綠素銅鈉鹽的耐熱性。取葉綠素銅鈉鹽溶液在不同溫度的水浴鍋中保溫40 min后冷卻，觀察溶液的顏色變化并測定A405.1 nm。④常見食品添加劑的影響。取葉綠素銅鈉鹽溶液，分別加入不同濃度的常見食品添加劑白砂糖、食鹽、淀粉溶液，靜置2 h，觀察溶液的顏色變化并測定溶液在A405.1 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收光譜圖繪制

2.1.1 紫菜葉綠素銅代鹽吸收光譜圖 按試驗(yàn)方法，用紫外可見分光光度計(jì)測定紫菜葉綠素銅代鹽浸提液在360～680 nm波長范圍內(nèi)的吸光度，結(jié)果如圖1。由圖1可以看出，浸提液吸光度在420 nm和650 nm處有兩個(gè)波峰，由于浸提液中存在蛋白質(zhì)、葉黃素、類胡蘿卜素等雜質(zhì)，其最大吸收峰接近408 nm[11]，因此試驗(yàn)以浸提液在650 nm處的吸光度表示其中葉綠素銅代鹽的含量。

2.1.2 紫菜葉綠素銅鈉鹽吸收光譜圖 用紫外可見分光光度計(jì)測定紫菜葉綠素銅鈉鹽水溶液在360～680 nm波長范圍內(nèi)的吸光度，結(jié)果如圖2。由圖2可以看出，紫菜葉綠素銅鈉鹽水溶液在380～680 nm有2個(gè)吸收峰，405.1 nm處的吸收峰為葉綠素銅鈉鹽所特有，而在630 nm處的吸收峰為葉綠素b特有，葉綠素銅鈉鹽的含量與紫菜中葉綠素b含量比值接近4∶1，符合《GB 3262-82食品添加劑 葉綠素銅鈉鹽》要求[12]，故在穩(wěn)定性試驗(yàn)中采用405.1 nm波長處的吸光度表示溶液中葉綠素銅鈉鹽的含量。

2.2 紫菜葉綠素銅代鹽制備條件的優(yōu)化

2.2.1 浸提溶劑對葉綠素銅代反應(yīng)的影響 使用不同浸提溶劑制備葉綠素銅代鹽，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，丙酮—乙醇混合液（V丙酮∶V乙醇=95∶5）作為浸提溶劑時(shí)制備效果最好，浸提液的A650 nm最高，其次是95%的丙酮，95%的甲醇提取效果最差。因此，后續(xù)試驗(yàn)選用丙酮—乙醇混合液作為葉綠素浸提溶劑。

2.2.2 丙酮—乙醇溶劑的配比對葉綠素銅代反應(yīng)的影響 使用按不同體積比混合配制的丙酮—乙醇溶劑制備葉綠素銅代鹽，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，丙酮—乙醇溶劑中V丙酮∶V乙醇=6∶4時(shí)混合液浸提效果最好，V丙酮∶V乙醇過高或過低均會降低葉綠素銅代鹽溶液的吸光度A650 nm。

2.2.3 銅化時(shí)間對葉綠素銅代反應(yīng)的影響 銅化時(shí)間不同，制得的葉綠素銅代鹽浸提液A650 nm變化情況見圖5。由圖5可以看出，葉綠素銅代鹽浸提液的A650 nm隨銅化時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢，銅化時(shí)間為12 h時(shí)A650 nm最高。

2.2.4 銅化液pH對葉綠素銅代反應(yīng)的影響 在不同pH條件下制備葉綠素銅代鹽，所得浸提液的A650 nm測定結(jié)果見圖6。由圖6可以看出，在酸性條件下，葉綠素銅代鹽浸提液吸光度基本不變，與未加酸時(shí)的A650 nm無顯著差異，故試驗(yàn)時(shí)不需要再對銅化液進(jìn)行酸化處理。

2.2.5 浸提時(shí)間對葉綠素銅代反應(yīng)的影響 浸提時(shí)間不同，制得的葉綠素銅代鹽浸提液A650 nm見圖7。由圖7可以看出，浸提時(shí)間從0.5 h延長到1.5 h，浸提液的A650 nm升高，1.5～2.0 h時(shí)浸提液A650 nm趨于穩(wěn)定，2.0 h后A650 nm隨浸提時(shí)間的延長呈降低趨勢，為使浸提充分，浸提時(shí)間為2.0 h較好。

2.2.6 液料比對葉綠素銅代反應(yīng)的影響 由于液料比對浸提效果的影響單純用吸光度來衡量不夠全面，可選用整個(gè)溶液中所含吸光物質(zhì)的量，即V×C來判斷[1]。根據(jù)朗伯-比耳定律[13]，A=εbC，A與C成正比，故以T（A650 nm×浸提液體積V×10）來衡量不同液料比條件下銅代反應(yīng)的效果。以不同的液料比制備葉綠素銅代鹽，所得葉綠素銅代鹽浸提液的T變化情況見圖8。從圖8可以看出，隨著V溶劑∶m紫菜的增大，T呈先升高后下降的趨勢，V溶劑∶m紫菜=60∶1（mL/g）時(shí)T最高。

2.2.7 浸提溫度對葉綠素銅代反應(yīng)的影響 在不同浸提溫度下制備葉綠素銅代鹽，所得浸提液的A650 nm見圖9。從圖9可以看出，在試驗(yàn)范圍內(nèi)浸提液的A650 nm隨著浸提溫度的升高而升高。考慮到葉綠素為熱敏性物質(zhì)，溫度過高會引起其分解，同時(shí)考慮到丙酮的揮發(fā)性，所以浸提溫度不宜過高，試驗(yàn)時(shí)選用50 ℃的浸提溫度。

2.2.8 紫菜葉綠素銅代鹽制備正交試驗(yàn)結(jié)果 選擇對葉綠素銅代反應(yīng)影響較大的4個(gè)因素，浸提溫度、浸提時(shí)間、丙酮—乙醇混合溶劑配比（V丙酮∶V乙醇）和液料比（V溶劑∶m紫菜），設(shè)置四因素三水平正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。為精確表示試驗(yàn)結(jié)果，表2中以T（A650 nm×浸提液體積V×10）表示浸提液中葉綠素銅代鹽的含量。由極差分析可知，各因素對葉綠素銅代鹽制備效果的影響由大到小依次為浸提溫度、浸提時(shí)間、V溶劑∶m紫菜、V丙酮∶V乙醇，最佳試驗(yàn)組合為A3B2C2D2，即浸提溫度50 ℃、浸提時(shí)間2.0 h、丙酮—乙醇溶劑中V丙酮∶V乙醇=6∶4、液料比V溶劑∶m紫菜=60∶1（mL/g）。在此條件下制備紫菜葉綠素銅代鹽，測得浸提液的A650 nm為0.547，T為328.2，大于所有正交試驗(yàn)組合的T值，說明此優(yōu)化條件可行。

2.3 皂化條件對紫菜葉綠素銅鈉鹽制備的影響

2.3.1 溫度和時(shí)間對皂化效果的影響 按試驗(yàn)方法制備紫菜葉綠素銅鈉鹽，考察皂化溫度與時(shí)間對皂化效果的影響。皂化后用石油醚萃取，靜置分層。上層萃取液呈現(xiàn)黃色，是葉黃素、蠟質(zhì)、甲醇、植物醇、胡蘿卜素等脂溶性雜質(zhì)，下層為深綠色的葉綠素銅鈉鹽皂化液，若上層全部變黃，下層全部為深綠色透明溶液，即分層清，表明皂化效果較好，紫菜葉綠素銅鈉鹽得率較高。在不同溫度與時(shí)間條件下進(jìn)行葉綠素銅鈉鹽的皂化，結(jié)果見表3。由表3可以看出，在溫度60 ℃、皂化時(shí)間40 min以上時(shí)可以得到較好的皂化效果，皂化溫度為70 ℃時(shí)易出現(xiàn)上層偏綠、分層不夠清的現(xiàn)象。

2.3.2 pH對皂化效果的影響 在不同pH條件下進(jìn)行皂化試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可以看出，皂化pH在11.51～11.93范圍內(nèi)效果較好，上層黃、分層清。皂化pH低于11.03時(shí)上層偏綠、分層不夠清。因此，制備紫菜葉綠素銅鈉鹽時(shí)適宜的皂化條件為水浴溫度60 ℃、pH 11.51～11.93、皂化時(shí)間長于40 min。按試驗(yàn)方法制取葉綠素銅鈉鹽，稱重，葉綠素銅鈉鹽得率為9.79%。

2.4 葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性

2.4.1 葉綠素銅鈉鹽的耐光性 葉綠素銅鈉鹽水溶液在暗處與可見光下分別放置不同時(shí)間，A405.1 nm隨放置時(shí)間變化的結(jié)果見圖10。由圖10可以看出，葉綠素銅鈉鹽水溶液在暗處放置時(shí)A405.1 nm變化較小；而在光照下A405.1 nm隨放置時(shí)間的延長而下降，損失較多，所以葉綠素銅鈉鹽應(yīng)放在避光處保存。

2.4.2 pH對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響 改變?nèi)~綠素銅鈉鹽水溶液的pH后測定其A405.1 nm，結(jié)果見圖11。試驗(yàn)過程中，pH由3升高到12，溶液均為澄清透明，并且A405.1 nm隨著pH的增大而升高，溶液顏色加深；pH在8～12范圍內(nèi)A405.1 nm趨于穩(wěn)定，說明葉綠素銅鈉鹽作為食品添加劑，在中性和弱堿性介質(zhì)中是穩(wěn)定的。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)葉綠素銅鈉鹽水溶液pH<3時(shí)會出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，而pH>12時(shí)A405.1 nm下降幅度很大。說明葉綠素銅鈉鹽在強(qiáng)酸及強(qiáng)堿性條件下不穩(wěn)定。

2.4.3 葉綠素銅鈉鹽的耐熱性 葉綠素銅鈉鹽水溶液的A405.1 nm隨水浴溫度變化而變化的結(jié)果見圖12。從圖12可以看出，在26 ℃（室溫）～80 ℃范圍內(nèi)葉綠素銅鈉鹽水溶液的A405.1 nm隨著溫度的升高略有減小，但變化幅度很小，說明葉綠素銅鈉鹽的耐熱性較好。溫度高于80 ℃時(shí)葉綠素銅鈉鹽水溶液的A405.1 nm下降幅度變大，保存率迅速下降，可見葉綠素銅鈉鹽不適宜在過高溫度下保存。

2.4.4 常用食品添加劑對葉綠素銅鈉鹽穩(wěn)定性的影響 分別向葉綠素銅鈉鹽水溶液中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的食鹽、白糖和淀粉，溶液的A405.1 nm測定結(jié)果見表5。加入食品添加劑后葉綠素銅鈉鹽水溶液的顏色均為亮綠色，A405.1 nm變化幅度很小，所以常用食品添加劑食鹽、白砂糖及淀粉對葉綠素銅鈉鹽基本沒有不良影響。

3 小結(jié)與討論

通過單因素和正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紫菜中葉綠素銅鈉鹽制備的最佳工藝條件為葉綠素銅化時(shí)間12 h、浸提溫度50 ℃、浸提時(shí)間2 h，丙酮與乙醇體積比6∶4的混合液作浸提溶劑，液料比V溶劑∶m紫菜=60∶1（mL/g）；皂化溫度60 ℃、皂化時(shí)間40 min以上、皂化液pH 11.51～11.93。在此條件下制備的紫菜葉綠素銅鈉鹽得率為9.79%。

對葉綠素銅鈉鹽的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)紫菜葉綠素銅鈉鹽耐光性較差，需在避光條件下保存；熱穩(wěn)定性較好，但溫度高于80 ℃時(shí)會導(dǎo)致其變性；pH 8～12時(shí)穩(wěn)定性較好，不耐強(qiáng)酸或強(qiáng)堿；食鹽、白砂糖、淀粉等常見食品添加劑對其無不良影響。

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（責(zé)任編輯 向 闈）