花生自身基因組原位雜交分析

摘要：利用自身基因組熒光原位雜交技術(shù)，對花生（Arachis hypogaea L.）進(jìn)行自身基因組原位雜交分析。結(jié)果顯示，雜交信號沿所有染色體的全長分布，染色體著絲粒區(qū)、近著絲粒區(qū)和部分DAPI深染的區(qū)域存在強(qiáng)烈的雜交信號，染色體遠(yuǎn)端的雜交信號偏弱，染色體上存在少數(shù)未觀察到雜交信號的DAPI深染區(qū)域。花生自身基因組原位雜交存在明顯的非均勻染色體雜交帶型，這說明基因區(qū)成簇分布在小的染色體區(qū)域并被重復(fù)序列間隔開。

關(guān)鍵詞：花生（Arachis hypogaea L.）；自身基因組原位雜交；重復(fù)DNA序列；基因組組織

中圖分類號：S565.2；Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0527-03

高等植物核基因組的一個(gè)顯著特征是含有大量的重復(fù)序列，如在玉米基因組中，重復(fù)DNA序列占85%以上[1]。重復(fù)序列是基因組大小差異和復(fù)雜性增加的主要原因[2]。根據(jù)重復(fù)序列在基因組中組織方式的不同，可初步分為串聯(lián)重復(fù)序列（Tandem repetitive sequence）、散在重復(fù)序列（Dispersed repetitive sequence）和片段重復(fù)序列（Segmental duplication）。弄清不同類型重復(fù)序列沿染色體的物理分布是解析植物基因組組織和進(jìn)化的關(guān)鍵之一。

全基因組測序方法是解析基因組組織和結(jié)構(gòu)最準(zhǔn)確的方法，但目前全基因組測序僅在模式植物和少數(shù)重要的作物中開展。基因組原位熒光雜交（Genomoic in situ hybridization，GISH）是熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)的一種，能直接揭示DNA序列沿染色體的分布模式，是研究基因組結(jié)構(gòu)特征的方法之一。對擬南芥[3]、水稻[4-6]、大麥[7]、甘薯[8]等植物自身基因組原位雜交（self-Genomoic in situ hybridization，self-GISH）的研究表明，自身基因組原位雜交技術(shù)是揭示植物基因組中重復(fù)序列在染色體上的分布以及基因組組織的有效方法。

花生（Arachis hypogaea L.）是重要的植物性食用油和蛋白質(zhì)來源，由花生屬（Arachis）的二倍體物種雜交加倍形成的異源四倍體（2n=4X=40，AABB），基因組大小約為2 800 Mb[9]。對花生染色體核型[10]、熒光顯帶[11]及rDNA物理定位[12，13]已有報(bào)道，但對花生基因組重復(fù)DNA序列的組織和結(jié)構(gòu)并不明晰。本研究擬用自身基因組原位雜交技術(shù)，初步揭示花生基因組重復(fù)DNA序列沿染色體的分布及與重復(fù)DNA相關(guān)聯(lián)的染色質(zhì)分化，為探究花生基因組的組織及結(jié)構(gòu)提供更多的資料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為珍珠豆型栽培花生中花8號，購于市場。

1.2 方法

1.2.1 染色體的制備 染色體制片按Song等[14]的方法稍加改進(jìn)。取生長旺盛的根尖，室溫用飽和α-溴萘水溶液處理3 h后用新鮮卡諾固定液固定。用2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的纖維素酶和2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的果膠酶28 ℃酶解，經(jīng)水洗、固定等步驟后采用火焰干燥法制片，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA的提取和探針標(biāo)記 花生基因組DNA采用CTAB法提取。通過切口平移的方法用生物素-dUTP（biotin-11-dUTP）標(biāo)記探針。切口平移標(biāo)記反應(yīng)體系含有基因組DNA 500 ng，DNA PolymeraseⅠ（Takara） 5 U，DNA PolymeraseⅠ的 10×Buffer 4 μL ，DNaseⅠ（Takara） 0.001 U，dATP、dGTP、dCTP各0.1 mmol，Bio- dUTP （Biotin-11-dUTP ∶ dTTP為 1∶2） 0.1 mmol，加ddH2O至40 μL，14 ℃反應(yīng)2 h，加2 μL 0.5 mol/L EDTA 80 ℃保溫5 min終止反應(yīng)。切口平移標(biāo)記的DNA片段用2%的瓊脂糖檢測。

1.2.3 原位雜交及檢測 原位雜交及信號檢測參照Li等[15]的方法并略作修改。染色體制片65 ℃烤片后，經(jīng)Rnase A（37 ℃，1 h）處理，接著用2×SSC配制的70%甲酰胺溶液70 ℃處理2.5 min，用75%乙醇、95%乙醇和無水乙醇在-20 ℃各脫水5 min，然后置室溫下干燥。每張片子加入40 μL雜交液，含100 ng標(biāo)記的DNA、50%的去離子甲酰胺（Sigma）、10%的硫酸葡聚糖（Sigma）、0.1% SDS、2×SSC、4 000 ng sssDNA，用22 mm×22 mm的蓋玻片蓋片，90 ℃共變性5 min，于保溫皿中37 ℃雜交24～48 h。雜交后的片子在42 ℃用2×SSC配制的20%甲酰胺溶液洗2次，每次5 min，接著用2×SSC在室溫及37 ℃各洗10 min，1×PBS室溫洗1次，加入Streptavidin-Cy3，37 ℃下溫育30 min，再用1×PBS室溫洗3次，每次5 min。

1.2.4 圖像檢測及分析 染色體制片用5 μL/mL 的熒光染料DAPI（4′，6-diamidino-2-phenylindole）復(fù)染，加抗淬滅劑Vectorshield（Vector Lab），用Olympus BX60 顯微鏡觀察熒光原位雜交信號，用Photometrics SenSys CCD（charge coupled device）1400E照相裝置和Metamorph 4.6.3（Universal Imaging Crop）軟件俘獲圖像，用Photoshop 7.0.1軟件進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

以中花8號基因組的總DNA為探針對其自身染色體進(jìn)行雜交，圖1顯示了中花8號自身基因組熒光原位雜交（self-GISH）結(jié)果。對染色體中期分裂相雜交結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1a）顯示雜交信號密集的沿所有染色體的長軸分布，單從雜交信號就可以看出染色體的輪廓，染色體著絲粒區(qū)、近著絲粒區(qū)和部分DAPI深染區(qū)域存在強(qiáng)烈標(biāo)記的雜交信號。在強(qiáng)烈標(biāo)記區(qū)域能觀察到交替分布的弱標(biāo)記區(qū)域。同時(shí)可以觀察到染色體遠(yuǎn)端的信號偏弱，染色體上存在少數(shù)未被雜交的區(qū)域。增強(qiáng)的信號散布于輕度標(biāo)記的或非標(biāo)記的染色體區(qū)，表現(xiàn)出染色體的非均勻雜交。大部分DAPI深染的染色質(zhì)區(qū)域有明顯增強(qiáng)的信號，但是還有幾個(gè)DAPI著色深的異染色質(zhì)區(qū)域沒有雜交信號。

為了排除DAPI著色深的異染色質(zhì)區(qū)域沒有雜交信號是由于染色質(zhì)凝縮程度過高而導(dǎo)致探針無法與目標(biāo)區(qū)域的DNA雜交，對染色質(zhì)凝縮程度較低的間期細(xì)胞核的雜交信號進(jìn)行了分析。結(jié)果（圖1b）表明，雜交信號分布于核區(qū)所有范圍。增強(qiáng)的雜交信號和輕度標(biāo)記的雜交信號交替分布，但可以觀察到增強(qiáng)的信號集中分布于核的一側(cè)，增強(qiáng)的雜交信號和輕度標(biāo)記的雜交信號分別占據(jù)間期核的不同區(qū)域。大部分DAPI著色深的異染色質(zhì)區(qū)域有明顯增強(qiáng)的信號，但還是有幾個(gè)DAPI著色深的異染色質(zhì)區(qū)域沒有檢測到雜交信號，這說明染色質(zhì)凝縮程度并不是決定這幾個(gè)區(qū)域能否雜交的關(guān)鍵因素。

3 討論

擬南芥、甘藍(lán)、大麥等其他植物[3，7，8，16-18]自身基因組熒光原位雜交圖型與轉(zhuǎn)座子、反轉(zhuǎn)座子等重復(fù)DNA 序列的FISH圖型相似，證實(shí)了基因組熒光原位雜交信號主要來自重復(fù)DNA 序列。有研究認(rèn)為，自身基因組熒光原位雜交圖型能在一定程度上反映植物基因組重復(fù)序列和基因在染色體水平上的組織情況，雜交信號強(qiáng)烈的區(qū)域應(yīng)當(dāng)富含重復(fù)序列，為異染色質(zhì)區(qū)域即基因貧乏區(qū)；輕度標(biāo)記或者非標(biāo)記的區(qū)域則應(yīng)當(dāng)是常染色質(zhì)區(qū)即基因富集區(qū)[7，19]。擬南芥、水稻、高粱等自身基因組熒光原位雜交結(jié)果顯示，基因組中的重復(fù)序列集中分布在近著絲粒的異染色質(zhì)區(qū)域，基因則分布在染色體遠(yuǎn)端缺乏重復(fù)序列的常染色質(zhì)區(qū)域，這與用其他方法分析的結(jié)論基本吻合[20，21]。

在本研究中，中花8號自身基因組熒光原位增強(qiáng)的信號主要位于DAPI深染區(qū)、著絲粒區(qū)、近著絲粒區(qū)，說明這些區(qū)域主要由重復(fù)DNA構(gòu)成。增強(qiáng)的信號散布于輕度標(biāo)記的或非標(biāo)記的染色體區(qū)域，說明基因區(qū)成簇分布在小的染色體區(qū)域并由重復(fù)序列間隔開。這與其他具有大基因組植物的組織模式基本一致[7，18，19]。

DAPI是雙鏈DNA 特異性染料，與富含AT堿基對區(qū)域結(jié)合量大而發(fā)出較強(qiáng)的熒光，一般推測DAPI深染區(qū)是異染色質(zhì)區(qū)。花生染色體的DAPI帶紋特征可以為花生染色體的識別和鑒定提供特征，為研究花生的起源提供更多的染色體資料[11]。值得注意的是，在花生自身基因組原位雜交過程中，有幾個(gè)DAPI著色深的異染色質(zhì)區(qū)域還是沒有檢測到雜交信號。玉米核仁組織區(qū)和染色質(zhì)紐在自身基因組原位雜交中也出現(xiàn)陰性信號[7]。類似的情況在其他幾個(gè)植物中也檢測到[18，22，23]。有學(xué)者認(rèn)為這是重復(fù)序列自我封阻阻止了某些小部分的重復(fù)DNA在特定雜交條件下與對應(yīng)染色體區(qū)域的雜交。從本實(shí)驗(yàn)中期染色體和間期核雜交的結(jié)果來看，某些高度重復(fù)序列在染色質(zhì)包裝的早期就形成了復(fù)雜的高級結(jié)構(gòu)，封阻了探針的進(jìn)入和雜交。

已有很多證據(jù)表明，重復(fù)序列對基因的調(diào)控和表達(dá)有一定的作用，異染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)可能對染色質(zhì)的包裝起到支持和腳手架的作用[24]。所以花生染色體上基因區(qū)與重復(fù)DNA序列區(qū)的分布特征為理解花生基因的組織和進(jìn)化動(dòng)力提供了一些有益數(shù)據(jù)。

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