煙草靶斑病菌毒素對煙草防御酶及丙二醛含量的影響

摘要：采用煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）粗毒素原液處理6葉期煙草幼苗，測定12、24、36、48、60、72 h后煙草葉片中過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性和丙二醛（MDA）含量。結果表明，經煙草靶斑病菌粗毒素處理后的煙草POD、PAL的活性及MDA含量都高于對照，并呈現一定的波動性；PPO和CAT先升高后下降，始終高于對照；而SOD酶的活性表現為持續(xù)下降。

關鍵詞：煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）；毒素；煙草；防御酶

中圖分類號：S432.4.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0575-03

真菌在侵染寄主植物過程中，毒素是其主要的致病因子之一，可在非常低的濃度范圍內干擾植物正常生理功能，破壞細胞超微結構，從而嚴重影響植物的代謝過程和能量變化，引起一系列的不良反應，導致植物生理失調，最終導致細胞死亡。立枯絲核菌毒素常引起水稻、小麥等農作物發(fā)病、萎蔫，甚至死亡[1，2]。煙草靶斑病是中國煙草上的新病害[3]，國內外對其研究相對較少。

此次試驗利用煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani）產生的粗毒素（以下簡稱毒素）對煙草防御酶活性及丙二醛（MDA）含量進行了研究，以探明該毒素的作用機理，為進一步研究煙草與立枯絲核菌互作及利用品種抗性育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2010年在沈陽農業(yè)大學植物病毒研究室進行，供試煙草品種為NC89。供試煙草靶斑病菌為強致病力菌株YC-9，由沈陽農業(yè)大學植物病毒研究室分離保存。

1.2 毒素制備

粗毒素提取參考Vidhyasekaran等[4]方法進行。將供試菌株于PDA平板上培養(yǎng)3 d，取10塊菌餅（直徑5 mm）移至100 mL改良Richard培養(yǎng)液中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d，每隔12 h人工振蕩1 次。培養(yǎng)液經過紗布和濾紙過濾、離心、活性碳吸附、甲醇洗脫等條件，獲得病菌粗毒素。

1.3 毒素處理及酶活性測定

于煙苗6葉期取新鮮葉片，用無菌水洗凈后針刺葉片造成傷口，然后處理組取20 μL濃縮后的粗毒素液接種于傷口上，對照組以空白培養(yǎng)液接種于傷口上，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于接種后12、24、36、48、60、72 h取樣。

參考高俊鳳[5]的方法測定過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）及苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，MDA含量采用硫代巴比妥酸反應比色法測定。

2 結果與分析

2.1 毒素對煙草葉片POD活性的影響

由圖1可以看出，毒素處理煙草葉片后12～24 h POD活性呈下降趨勢，但明顯高于對照；24～36 h POD活性呈升高趨勢；處理36～48 h時再次呈下降趨勢；處理60 h時POD活性再次升高并達到最大值，直至處理72 h時仍保持較高的活性。

2.2 毒素對煙草葉片PPO活性的影響

由圖2可以看出，毒素處理煙草葉片后其PPO活性隨處理時間的延長先上升后下降，對照則相對平穩(wěn)。處理12～24 h PPO活性比對照低，呈現緩慢升高的趨勢，24 h后PPO活性開始急劇升高，明顯高于對照，48 h時達到高峰，此后PPO活性開始下降，至72 h依然高于對照。

2.3 毒素對煙草葉片SOD活性的影響

由圖3可以看出，毒素處理煙草葉片后其SOD活性持續(xù)下降，明顯低于對照。處理12～24 h時其SOD活性無明顯變化，但低于對照，而36 h開始急劇下降，72 h時其SOD活性降至最低，并呈現持續(xù)下降的趨勢。

2.4 毒素對煙草葉片CAT活性的影響

由圖4可以看出，毒素處理煙草葉片后其CAT活性隨處理時間的延長呈現先升高后下降的趨勢。12～24 h其CAT活性急劇上升，24 h時酶活達到高峰，明顯高于對照，此后CAT活性驟然下降，72 h時低于對照；而對照在此期間呈現小幅度的波動狀態(tài)，在12～24 h煙草葉片SOD活性呈現緩慢下降趨勢，24～36 h緩慢升高，36～48 h開始下降，在48～72 h呈上升趨勢。

2.5 毒素對煙草葉片PAL活性的影響

由圖5可以看出，毒素處理煙草葉片后的PAL活性變化較大，在12～72 h出現2個酶活高峰，分別在處理24 h和72 h時，并且毒素處理的PAL活性始終高于對照；而對照PAL活性的變化也呈現波動狀態(tài)，但變化幅度較小。

2.6 毒素對煙草葉片MDA含量的影響

由圖6可以看出，毒素處理后煙草葉片MDA的含量出現了2個高峰。在毒素處理12 h時其MDA含量比對照低，此后迅速上升，于24 h時達到高峰，而24～48 h呈現下降趨勢，48～60 h時又緩慢上升；而對照的MDA含量表現出波動，但變化幅度相對較小。

3 小結與討論

毒素可導致煙草葉片組織內防御系統(tǒng)酶活性發(fā)生變化，POD、PPO和CAT是具有清除活性氧作用的防御酶，寄主體內防御酶系統(tǒng)變化是致病毒素作用于寄主后的明顯反應之一[6]。本試驗研究表明，經煙草靶斑病菌粗毒素處理后，煙草葉片POD活性高于對照水平，并呈現一定的波動性，而PPO和CAT表現為先升高后降低，但大部分時間高于對照水平。這表明煙草靶斑病菌毒素可能誘導了煙草細胞活性氧暴發(fā)，POD、PPO和CAT活性升高以清除活性氧，但隨著毒素處理時間延長產生大量活性氧導致PPO和CAT活性開始下降，并因活性氧大量積累使細胞受到損傷。史俊卿等[7]用立枯絲核菌毒素處理人參幼苗，發(fā)現其PPO和CAT活性都呈先上升后下降趨勢，此次試驗的結果與其基本一致。

SOD能夠直接清除超氧陰離子自由基，往往在其他防御酶活性降低時發(fā)揮直接補償作用，減輕活性氧對寄主的傷害，但如果活性氧大量產生，超出了體內的清除能力，則會引發(fā)和加劇膜脂過氧化作用，破壞膜的結構和功能，甚至導致植物細胞死亡。而此次試驗SOD酶的活性表現為持續(xù)下降，可能是由于毒素致使細胞產生大量超氧陰離子，SOD與超氧陰離子發(fā)生作用，而使其活性降低。史俊卿等[7]研究SOD活性都表現為先升高后下降，此次試驗結果與其并不完全一致。

PAL是能合成各種酚類化合物及木質素的關鍵酶，調控著酚類物質和木質素在植物體中的合成和積累，因而在植物抗病反應中起著重要作用[6]。病原菌毒素能誘導PAL活性升高。劉瓊光[8]用水稻基腐病菌毒素處理水稻，臺蓮梅等[9]用尖孢鐮刀菌毒素處理大豆幼根，范蘭蘭等[10]用蓮子草假隔鏈格孢毒素處理蓮子草根，都證明了毒素對寄主體內PAL活性的誘導作用。此次試驗研究表明經煙草靶斑病菌粗毒素處理后的煙草葉片PAL活性高于對照水平，出現2個高峰。在用毒素接種煙草的前期試驗中，接種葉片組織變褐色，形成褐色壞死病斑，可能與PAL活性升高，細胞內酚類物質大量積累、組織遭到破壞有關。

植物組織遭受傷害，往往會發(fā)生膜脂過氧化作用，MDA是膜脂過氧化的最終分解產物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度[11]。本研究中煙草葉片MDA含量在處理24 h時達到了高峰，盡管出現波動，基本都高于對照水平。這與史俊卿等[7]研究結果基本一致。隨著MDA含量不斷升高，植物組織膜脂過氧化的程度逐漸加劇，最終導致細胞死亡。

參考文獻：

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