花椒子不同提取物的體外抑菌效果

摘要：為研究花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxin）子提取物的體外抑菌作用，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、蒸餾水5種試劑從花椒子中提取其活性成分進行抑菌試驗。結果表明，花椒子的抑菌活性部位是乙酸乙酯和水的提取物，其中乙酸乙酯提取物的抑菌作用較強，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）分別為12.500 mg/mL和25.000 mg/mL，對大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為25.000 mg/mL和50.000 mg/mL。試驗表明花椒子提取物在體外對細菌有一定的抑制作用。

關鍵詞：花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxin）子；提取物；抑菌效果

中圖分類號：S482.29 文獻標識碼： A 文章編號：0439-8114（2013）03-0578-02

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxin）屬蕓香科多年生灌木或小喬木，主要分布在四川、山西、山東及秦嶺以南等地區[1]。截至2009年底，四川省花椒種植面積為8.04 hm2，總產量21 000 t，產值5.7億元。四川漢源縣是花椒的著名產地，漢源花椒以皮厚肉豐、色艷味濃而聞名全國，有“貢椒”之稱[2]。花椒子是花椒果皮生產中的主要副產物，但長期以來一直未被利用，在產地大量的花椒子被當作燃料燒掉或作為肥料，甚至被當作廢物丟棄。

花椒子黑色、有光澤，內含豐富的油脂和蛋白質，占花椒總產量的60%～70%。花椒和花椒子均可以作為藥材，花椒子在中藥中被稱為椒目，該藥味苦、辛，性寒，有小毒，具有利水、平喘之功；主治水腫脹滿、痰飲喘逆等癥[3，4]。目前，對花椒的研究主要集中在根、葉、子、果皮的化學成分分析，生物藥理活性及花椒的加工應用[5]等方面，而對花椒子的抑菌作用鮮有研究。本試驗采用管碟法，研究花椒子提取物對常見的幾種病原菌的抑制作用，為花椒子的進一步開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

花椒子2011年采自四川漢源縣，經四川農業大學動物醫學院藥學系范巧佳副教授鑒定為正品。

1.2 供試菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella）由四川農業大學藥學實驗室提供。

1.3 材料及試劑

材料包含索氏提取器、旋轉蒸發儀、恒溫培養箱、培養皿、超凈工作臺、滅菌鍋、微量加樣器、鋼管。試劑石油醚（b.p.60～90 ℃）、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 花椒子不同提取物的制備 取花椒子粉末10 g，加90 mL石油醚索氏法提取3 h，提取液濃縮，得石油醚提取液；殘渣再用乙酸乙酯90 mL提取3 h，濃縮得乙酸乙酯提取液；藥渣再用正丁醇90 mL提取3 h，濃縮得正丁醇提取液；藥渣晾干再用80 mL無水乙醇提取3 h，提取液濃縮得無水乙醇提取液；藥渣晾干再用80 mL蒸餾水在80 ℃水浴提取4 h，過濾得水提液。

1.4.2 細菌的活化及菌懸液的配制 將供試菌種接入相對應的試管斜面培養基上，將供試菌種活化，細菌置37 ℃恒溫培養箱內培養18～24 h，在無菌操作的條件下，取培養活化好的菌株，用接種環挑取少量菌體，用無菌生理鹽水配制成菌體懸浮液，使菌懸液濃度達到106～107 CFU/mL。

1.4.3 體外抑菌試驗 體外抑菌試驗采用管碟法進行[6]。用無菌棉簽蘸取濃度為106～107 CFU/mL的細菌稀釋液，涂布于普通營養瓊脂平板上，用無菌鑷子將鋼管均勻擺放平板上，靜置10～15 min后滴加花椒子提取液，加至液面與鋼管表面平行即可。將平板37 ℃培養18～24 h后，用游標卡尺測量抑菌圈大小。分別用相應試劑做對照。

1.4.4 試驗結果判定標準 試驗結果判定標準：抑菌圈直徑大于20 mm為高度敏感，10～19 mm為中度敏感，小于10 mm為低度敏感[7]。

1.4.5 最小抑菌濃度（MIC）的測定 采用試管二倍稀釋法[8]。將抑菌效果最好的提取原液用相應溶劑倍比稀釋，依次配成濃度為50.000、25.000、12.500、6.250、3.125、1.563 mg/mL 6個濃度的肉湯培養基試管，向各管中添加菌懸液50 μL，置于37 ℃條件下恒溫培養。18～24 h 后，觀察記錄各試管是否長菌及生長情況。每個濃度梯度做3組平行試驗，不長菌的最小濃度為該樣品的最小抑菌濃度。以相應試劑做對照試驗。

1.4.6 最小殺菌濃度（MBC）的測定 在最小抑菌濃度的基礎上，分別將無細菌生長試管的肉湯培養基劃線接種于瓊脂平板上，置于37 ℃條件下恒溫培養18～24 h，以瓊脂平板上無菌落生長的提取液濃度為最小殺菌濃度。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑提取液抑菌效果比較

由表1可以看出，花椒子的乙酸乙酯提取液和水提液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑菌效果。抑菌活性為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌，且乙酸乙酯提取液的抑菌效果優于水提液。石油醚、正丁醇和無水乙醇提取液無抑菌活性，且5種提取液對沙門氏菌都無抑菌效果。

2.2 花椒子乙酸乙酯提取液最小抑菌濃度的確定

把抑菌效果較好的乙酸乙酯提取液稀釋為不同濃度，進行最小抑菌濃度試驗，測定結果見表2。乙酸乙酯提取液對金黃色葡萄球菌的MIC為12.500 mg/mL，對大腸桿菌的MIC為25.000 mg/mL，說明花椒子提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好。

2.3 花椒子乙酸乙酯提取液最小殺菌濃度的確定

由表3可知，乙酸乙酯提取液對金黃色葡萄球菌的最小殺菌濃度為25.000 mg/mL，對大腸桿菌的為50.000 mg/mL，說明花椒子提取液對金黃色葡萄球菌的殺菌效果較好。

3 小結與討論

通過抑菌試驗確定花椒子的抑菌活性成分主要是極性很小的親脂性成分及水溶性成分，其具體抑菌成分有待進一步研究。

同時抑菌試驗證明了花椒子對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有良好的抑菌活性。花椒子的抑菌活性部位是乙酸乙酯和蒸餾水的提取物。乙酸乙酯的提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為16 mm和13 mm，均為中度敏感；水提液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為11 mm和7 mm，分別為中度敏感和低度敏感。可知乙酸乙酯提取物的抑菌作用較強，對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為12.500 mg/mL和25.000 mg/mL，對大腸桿菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度分別為25.000 mg/mL和50.000 mg/mL。且對金黃色葡萄球菌的抑制作用相對較強，對大腸桿菌的抑制作用相對稍弱。

本試驗選用常見致病菌作為研究對象。金黃色葡萄球菌是動物和人類的一種重要病原菌，可引起許多嚴重的感染性疾病；大腸桿菌是畜禽最常見的病原菌之一，可引起胚胎死亡、臍炎、腦炎等一系列病癥，發病率及死亡率高。本試驗已初步確定花椒子提取物對這兩種細菌均有抑制作用，為臨床常見疾病的生物防治以及為花椒子擴大藥源提供了理論依據，以期實現花椒子資源的充分利用。

參考文獻：

[1] 趙志峰，雷 鳴，雷紹榮，等.兩種四川花椒揮發油的成分分析[J].中國調味品，2004，10（10）：39-42.

[2] 祝瑞雪，曾維才，趙志峰，等.漢源花椒精油的化學成分分析及其抑菌作用[J].食品科學，2011，32（17）：85-88.

[3] 江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1977.

[4] 李時珍.本草綱目[M].北京：人民衛生出版社，1982.

[5] 劉鎖蘭，魏璐雪，王 動，等.青花椒化學成分的研究[J].藥學學報，1991，26（11）：836-840.

[6] 崔清蘭，黃京燕，王莉娟.雙黃連注射液的管碟法體外抑菌試驗及其應用[J].河南畜牧獸醫，2004，25（1）：42.

[7] 杜 銳，韓文瑜，雷連成.金黃色葡萄球菌中藥抑菌劑的篩選研究[J].中國獸藥雜志，2006，40（9）：10-13.

[8] 劉勝貴，許方美，張蘭蘭.植物提取物體外抑菌試驗的方法研究[J].懷化學院學報，2006，25（2）：65-67.