暗紋東方鲀致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定

摘要：從瀕死的暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）體內分離到一株優勢菌株，經形態觀察、生化、16 S rDNA聚合酶鏈式反應（PCR）以及人工感染健康暗紋東方鲀和ICR小鼠等試驗可知，該菌對小鼠和暗紋東方鲀半數致死量（LD50）分別為2.26×106 CFU/mL、5.96×104 CFU/mL；其16 S rDNA序列與維氏氣單胞菌具有高度的同源性，根據該菌的形態特征、生理生化特性，初步鑒定該菌為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii），命名為NT-HV。選擇9種水產常用藥物進行藥敏試驗，結果顯示該菌對氟苯尼考、復方新諾明、新霉素、氧哌嗪青霉素敏感，對養殖場常用的四環素、強力霉素、羧芐青霉素、氨芐青霉素不敏感，提示在藥物的使用過程中應注意藥物的濃度和合理輪換。

關鍵詞：暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）；維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）；致病性；分離；鑒定

中圖分類號：S941.42 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0629-04

2010年10月，江蘇某特種水產養殖場養殖的暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）發生死亡。病魚主要表現為腹部極度膨大，肛門紅腫，體表及胸鰭、腹鰭和臀鰭殘缺，鰭條基部充血、出血。解剖發現腹腔內有大量淡黃色帶血的腹水流出；肝臟腫大，呈土黃色，有大小不一的出血斑塊；膽囊膨大；腸道無食，充滿泡沫狀黏液，腸黏膜出血。取癥狀典型的瀕死暗紋東方鲀心臟、肝臟病灶進行細菌分離培養，獲得一株優勢菌株。本研究通過對分離菌進行形態觀察、生理生化試驗、16 S rDNA序列分析，初步鑒定該菌為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii），命名為NT-HV，同時對其毒力及藥物敏感性進行試驗，旨在分析該菌的分類地位、致病因素、篩選敏感藥物，為有效防治暗紋東方鲀維氏氣單胞菌病提供依據。

1 材料與方法

1.1 病料

病料取自江蘇某特種水產養殖場，瀕死暗紋東方鲀體表出血，鰭條缺失、出血，肛門紅腫、突出。解剖后發現，腹腔極度積水，肝臟腫大、出血。

1.2 實驗動物

清潔級6周齡成年雄性ICR小鼠，體重（25±2） g，由南通大學實驗動物中心提供。暗紋東方鲀購自水產市場，每尾重80～100 g，試驗前在持續流水的水泥池（500 L）中馴養2周，證實健康無病后用于試驗。試驗期間水溫控制在25 ℃左右，投喂暗紋東方鲀專用配合飼料。

1.3 試劑

Taq DNA酶和DNA Marker（DL 2000）購自TaKaRa公司；細菌微量生化鑒定管、藥敏試紙購于杭州天和微生物試劑有限公司，小量細菌基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司（批號SK8255），其他試劑均為分析純。

1.4 病原分離

選擇具有典型癥狀、瀕死的暗紋東方鲀，無菌操作取其心臟、肝臟，大豆酪蛋白瓊脂培養基（Tryptose soya agar，TSA）平板劃線分離細菌，30 ℃培養24 h，選取優勢菌在TSA平板上純培養，挑取單個菌落進行革蘭氏染色，光學顯微鏡下觀察。將分離菌株用斜面保存。

1.5 生化試驗

取斜面保藏菌株進行動力試驗及微量生化管試驗。動力試驗用半固體營養瓊脂穿刺培養。微量生化管試驗按產品使用說明操作。

1.6 溶血活性檢測

將分離菌接種至血液瓊脂（含7%家兔脫纖血的營養瓊脂）培養基，30 ℃培養24 h，觀察菌落周圍是否出現溶血圈。

1.7 毒力試驗

將分離菌接種至胰酪胨大豆肉湯（TSB）培養基，30 ℃ 靜置培養36 h，5 000 r/min離心10 min，收集菌體，0.15 mol/L NaCl稀釋菌體，用活菌計數法[1]測定菌液濃度，并將菌液稀釋為1.8×108、0.9×108、1.8 ×107、0.9×107、1.8 ×106、0.9×106、1.8 ×105、0.9×105 CFU/mL共8個濃度梯度，每個濃度接種6只ICR小鼠（腹腔注射，0.2 mL/只）和10尾健康暗紋東方鲀（鰭背注射，0.2 mL/只），對照組注射等量的無菌生理鹽水。連續觀察7 d并記錄小鼠和暗紋東方鲀的死亡時間和數量。按Reed-Muench法計算分離菌的半數致死量（LD50）。

1.8 16 S rDNA基因序列測定與系統發育學分析

1）PCR模板DNA的制備。將分離菌株接種于TSB培養基，30 ℃ 培養16 h，小量細菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌體DNA作為PCR模板。

2）16 S rDNA基因序列的PCR擴增與測序。設計16 S rDNA基因的2條通用引物：27F（正向引物）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R（反向引物）：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由上海英俊生物技術有限公司合成，-20 ℃保存備用。50 μL反應體系：無菌超純水36 μL，10×PCR Buffer 5 μL，1.5 mmol/L MgCl2 4 μL，4×dNTPs 1.0 μL，引物各0.5 μL ，2.5 U/μL 的Taq DNA聚合酶1.0 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃復性1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃溫育6 min。PCR擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因序列測定。

3）16 S rDNA基因序列同源性分析及系統發育樹構建。通過NCBI的BLAST檢索系統（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）對供試菌株的16 S rDNA基因序列進行同源性分析后，從結果中獲取相似的23種氣單胞菌菌株16 S rDNA基因序列，并利用Mega 4軟件構建系統發育樹。

1.9 藥敏試驗

根據第一批正式轉為國家標準的漁藥目錄[2]，選取復方新諾明、新霉素、氟苯尼考、氧哌嗪青霉素、四環素、強力霉素、羧芐青霉素、氨芐青霉素藥敏試紙，按試紙說明進行試驗，并用保藏的Escherichia coil BL21作為對照菌，30 ℃培養16 h觀察結果。

2 結果與分析

2.1 分離菌的形態及培養特性

光學顯微鏡下觀察，分離菌為革蘭氏染色陰性、散在、兩端鈍圓、無芽孢的小桿菌。經30 ℃培養24 h，菌落在TSA平板上為不透明、表面光滑、略凸、直徑3～4 mm、邊緣整齊的乳白色菌落；在血液瓊脂培養基上（含7%家免脫纖血的營養瓊脂）培養24 h呈β-溶血。

2.2 分離菌的生理生化特性

取斜面保藏菌株進行動力試驗及微量生化管試驗，結果顯示該菌具有動力性，不發酵木糖、鼠李糖、山梨醇等，不產硫化氫，尿素試驗陰性，半乳糖和枸櫞酸鹽試驗陽性，其他生化特性見表1。通過細菌生化試驗，初步確認該菌為維氏氣單胞菌，命名為NT-HV。

2.3 毒力試驗結果

用不同濃度的分離菌NT-HV菌液分別接種ICR小鼠和健康暗紋東方鲀，小鼠每組6只，暗紋東方鲀每組10尾，接種后觀察并記錄每組的死亡情況，結果如表2所示。分離菌NT-HV對小鼠和暗紋東方鲀均具毒力。按Reed-Muench法計算該菌對小鼠和暗紋東方鲀的LD50分別為2.26×106 CFU/mL、5.96×104 CFU/mL。小鼠人工感染后主要臨床癥狀為精神萎靡，食欲不振，腳趾、鼻尖出血；解剖癥狀為腹膜充血，肝臟壞死，腸道臌氣，脾腫大。暗紋東方鲀人工感染后主要臨床癥狀為肛門紅腫，體表及胸鰭、腹鰭和臀鰭基部充血、出血；解剖發現其肝臟腫大，有大小不一的出血斑塊，腸黏膜出血。

2.4 16 S rDNA基因的測定及分析

以菌株NT-HV的基因組DNA為模板，PCR擴增16 S rDNA 片段，測序結果顯示克隆片段長1 444 bp。將其基因序列用BLAST進行同源性比較，依據同源性檢索結果，選取不同氣單胞菌種屬的代表株構建系統發育樹，其與維氏氣單胞菌16 S rDNA基因序列相似性為99%（圖3）。因而，從分子水平上進一步證實分離菌株NT-HV為維氏氣單胞菌。

2.5 藥敏試驗結果

藥敏試驗結果顯示氟苯尼考、復方新諾明、新霉素、氧哌嗪青霉素為該菌的敏感藥物，四環素、強力霉素、羧芐青霉素、氨芐青霉素對該菌無作用，對照菌E. coil BL21對上述藥物均有敏感性。

3 討論

維氏氣單胞菌又稱凡隆氣單胞菌、維羅納氣單胞菌，1983年美國疾病預防與控制中心為紀念法國微生物學家Veron在弧菌和氣單胞菌研究中的貢獻而命名。該菌普遍存在于淡水、污水、土壤乃至海水中，其中一部分菌株在微生態環境中正常存在，而另一些菌株具有致病性，主要感染變溫動物，如中華絨螯蟹、框鏡鯉、中國大鯢、錦鯉、西伯利亞鱘等[3-7]，可引起大量死亡；維氏氣單胞菌對恒溫動物是一種條件致病菌，但有人認為免疫功能健全者也可被感染[8]，通常患者發生急性腹瀉，也可能引起菌血癥、腦膜炎和心內膜炎等[9，10]。近年來，日益增多的病例表明維氏氣單胞菌已成為一種重要的人-魚共患致病菌，在食品安全上有重要的研究意義，部分國家已經將其規定為食品安全的檢疫對象。

暗紋東方鲀俗稱河豚，是具有極高經濟價值的特種水產養殖對象，隨著暗紋東方鲀人工繁殖、營養及無毒人工養殖等綜合養殖技術的不斷完善，暗紋東方鲀高密度、集約化養殖規模不斷擴大，病害已成為制約該行業發展的主要因素之一。維氏氣單胞菌引起的暗紋東方鲀疾病在生產實踐中已經出現并在同一養殖場連年發生，造成一定的經濟損失。本研究對暗紋東方鲀病變組織進行細菌分離純化，獲得一株致病性維氏氣單胞菌，在國內外首次報道暗紋東方鲀相關疾病，為暗紋東方鲀維氏氣單胞菌病的防控提供參考。

本研究將分離菌株NT-HV分別人工感染ICR小鼠和健康暗紋東方鲀，引起小鼠和暗紋東方鲀發生死亡，半數致死量都很小，證實分離株具有較強的致病性，這一結果和Sung等[11]報道的對蝦的半數致死量相當。通過三個養殖周期的記錄分析，每年10月份氣溫逐漸下降，露天養殖的暗紋東方鲀進入溫室，環境變化、魚體在轉運過程中的應激反應等因素是導致疾病發生的原因，在該種疾病的防治過程中應引起重視。

抗菌藥物的使用是動物生產和疫病防治的重要措施，但抗菌藥物的不科學使用，致使藥物殘留、環境污染和細菌耐藥已經成為一個世界關注的獸醫公共衛生問題。本研究藥敏試驗選取的藥物是中國水產養殖中允許使用的常用藥物，其中四環類素藥物耐藥性的產生原因值得關注，通過對養殖現場的調研發現土霉素是該場常用藥，這可能是產生耐藥性的主要原因之一，同時提示在藥物的使用中應注意藥物的濃度和合理輪換。雖然本研究選取敏感藥物有效控制了暗紋東方鲀的發病，但該菌的耐藥性正逐漸形成，應予以高度重視。

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