響應面法優化超臨界CO₂法萃取廢棄煙葉中類胡蘿卜素的工藝條件

摘要：采用超臨界CO2法萃取廢棄煙葉中類胡蘿卜素，以類胡蘿卜素提取率為指標，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法對萃取工藝的關鍵因素萃取壓力、萃取溫度、萃取時間和CO2流速進行優化。結果表明，萃取溫度、萃取壓力和CO2流速的交互作用對煙葉中類胡蘿卜素的提取率影響極顯著；萃取壓力的影響顯著。優化得到超臨界CO2法提取煙葉中類胡蘿卜素的最優條件為萃取壓力23.53 MPa、萃取時間1.72 h、萃取溫度50.00 ℃、CO2流速8.05 L/h，此條件下煙葉中類胡蘿卜素的提取率為285.1 μg/100 g。

關鍵詞：煙草；類胡蘿卜素；超臨界CO2萃取；響應面法

中圖分類號：S572；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0654-05

煙草中的類胡蘿卜素主要包括胡蘿卜素和葉黃素，此外還有少量胡蘿卜素的含氧衍生物。類胡蘿卜素作為煙草中許多重要致香成分的前體物，對煙氣香味品質的形成具有重要作用。同時，類胡蘿卜素具有抗氧化、抗癌、保護心血管和增強免疫力等多種生物學功能[1-3]。中國是煙草生產大國，每年有450萬～500萬t出產，產生90萬～150萬t煙草廢棄物[4]。如何充分發揮這些“廢棄物”的潛在價值，變廢為寶，提高煙葉的利用率是目前亟待解決的問題。

超臨界流體萃取技術是一項基于高于臨界溫度和壓力的流體對被萃取物具有很好的溶解能力的性能，對物質進行分離和提取的新型分離技術，具有無毒、無害、無污染等優點。采用超臨界萃取技術提取類胡蘿卜素，所得產品中無溶劑殘留，可在較低溫度下操作，為類胡蘿卜素的提取提供了有效的方法[5-10]。

本研究在超臨界CO2法萃取廢棄煙葉中類胡蘿卜素的基礎上，采用Box-Behnken響應面法對萃取條件進行優化，對煙草廢棄物的綜合利用和卷煙加香減害具有重要的現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本試驗所用廢棄煙葉取自青島卷煙廠。將廢棄煙葉在50 ℃下烘干，用植物粉碎機粉碎，過40目篩，將煙粉裝袋，貼上標簽作為待測樣品。

主要試劑包括石油醚（沸程60～90 ℃，天津凱通化學試劑有限公司）、無水Na2SO4與無水乙醇（分析純，天津凱通化學試劑有限公司）、CO2氣體（洛陽氮肥廠）等；主要儀器有植物樣品粉碎機、試驗篩（孔徑0.42 mm）、TC-6K型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）、752N紫外可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）、HL-（5+1）L/50-ⅢBQ型超臨界流體（CO2）萃取裝置（杭州華黎泵業有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 超臨界CO2法提取煙葉中類胡蘿卜素 準確稱取粉碎得到的煙粉100 g，裝入萃取器中，使煙末充分溶于超臨界CO2中，設定超臨界流體（CO2）萃取裝置的萃取溫度、萃取壓力、CO2流速等條件，萃取一定的時間。

1.2.2 萃取液分析 將接收瓶中萃取液經漏斗過濾，取下部透明濾液裝入小燒杯中待用。向小燒杯中加入適量無水Na2SO4，充分吸收濾液中的水分后過濾，將濾液移入50 mL的容量瓶中。向容量瓶中加入適量石油醚，定容。溶液混合均勻后，取適量分裝入3個比色皿，以石油醚作對照，在450 nm波長處測定溶液的吸光度，并記錄數據。計算類胡蘿卜素提取率。

提取率=A1×C/（A0×m）×V

式中，A1為樣品在450 nm處的吸光度；C為β-胡蘿卜素石油醚標準液的濃度，試驗采用10 mg/mL β-胡蘿卜素石油醚溶液作為標準液；A0為10 mg/mL β-胡蘿卜素石油醚溶液在450 nm處的吸光度，試驗中測得為2 500；m為煙葉粉末樣品質量（g）；V為樣品中總胡蘿卜素萃取液的體積（mL）。

1.2.3 單因素試驗 設置單因素試驗分別考察超臨界CO2萃取時萃取壓力、萃取溫度、萃取時間和CO2流速對類胡蘿卜素提取率的影響。①萃取壓力。萃取溫度50 ℃、CO2流速8 L/h、萃取時間2.0 h，萃取壓力分別為10、15、20、25、30 MPa。②萃取溫度。CO2流速8 L/h、萃取時間2.0 h、萃取壓力20 MPa，萃取溫度分別為35、40、45、50、55 ℃。③萃取時間。CO2流速8 L/h、萃取時間2.0 h、萃取壓力20 MPa、萃取溫度50 ℃，萃取時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。④CO2流速。萃取壓力20 MPa、萃取溫度50 ℃、萃取時間1.5 h，CO2流速分別為6、7、8、9、10 L/h。

1.2.4 響應面試驗 采用Design-Expert軟件設計響應面試驗，根據單因素試驗結果確定響應面試驗各因素的水平范圍，選用Box-Behnken模型，以煙葉中類胡蘿卜素的提取率為響應值，做四因素三水平共29個試驗點的二次回歸正交組合設計試驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 萃取壓力對類胡蘿卜素提取率的影響 在超臨界萃取過程中，壓力是影響溶解度的主要因素之一，不同萃取壓力對煙葉中類胡蘿卜素提取率的影響結果見圖1。從圖1可以看出，試驗范圍內類胡蘿卜素提取率隨著萃取壓力的增大而升高，萃取壓力從10 MPa增大至20 MPa，提取率大幅度升高；當萃取壓力從25 MPa增大到30 MPa時，提取率增加緩慢。考慮到壓力過大會增加設備投資，故萃取壓力選擇20 MPa。

2.1.2 萃取溫度對類胡蘿卜素提取率的影響 不同萃取溫度對類胡蘿卜素提取率的影響結果見圖2。從圖2可以看出，類胡蘿卜素提取率隨萃取溫度的升高先上升，萃取溫度為45 ℃時達到最高，繼續升高溫度，提取率反而略有下降。萃取溫度升高時溶質的飽和蒸汽壓上升，會使溶解度增加，但溫度上升也會引起CO2密度下降，導致溶解度下降。此外，萃取溫度過高會造成類胡蘿卜素有效成分的分解，含量下降，因此萃取溫度不宜過高。

2.1.3 萃取時間對類胡蘿卜素提取率的影響 不同萃取時間對類胡蘿卜素提取率的影響結果見圖3。從圖3可以看出，萃取時間從0.5 h延長到1.5 h，提取率隨萃取時間的增加而快速升高，1.5 h后提取率變化不大。這是因為萃取開始階段，原料中類胡蘿卜素含量較高，濃度差大，在超臨界流體中擴散迅速，溶解度大，所以此階段提取率增加較快。隨著萃取時間的延長，原料中類胡蘿卜素與超臨界流體的濃度差降低，有效成分的溶出困難，提取率變化較小。

2.1.4 CO2流速對類胡蘿卜素提取率的影響 CO2流速對類胡蘿卜素提取率的影響結果見圖4。由圖4可知，隨著CO2流速的增加，溶質與溶劑之間的傳質推動力增大，傳質效率提高，提取率也隨之升高；但當CO2流速高于8 L/h時，提取率隨著流速的增加而降低，這是由于流速過大使溶劑與溶質之間的傳質時間變短，提取率減小。

2.2 響應面試驗結果

根據單因素試驗結果確定響應面各因素及水平如表1所示。采用Design-Expert軟件，選用Box-Behnken模型，以煙葉中類胡蘿卜素的提取率為響應值，設計四因素三水平共29個試驗點的響應面試驗，試驗結果如表2所示。利用Design Expert 軟件對響應面試驗結果進行二次多元回歸擬合，得到煙葉中類胡蘿卜素的提取率對自變量A、B、C和D的二次多項式回歸方程：R=281.26+9.80A+7.06B+21.59C+6.68D+8.02AB-1.12AC+21.35AD+3.90BC+1.30BD-2.25CD-39.07A2-28.13B2-4.21C2-23.77D2。

對上述回歸模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，此模型F值為9.64，P<0.000 1，回歸模型的決定系數R2=0.906 0，表示模型是極顯著的，試驗指標與所選因素之間存在極顯著的回歸關系，試驗設計方案正確，因此可用此模型對煙葉中類胡蘿卜素的提取率進行分析。

回歸模型中的C（萃取溫度）、AD （萃取壓力和CO2流速的交互作用）、A2、B2及D2的P值均小于0.01，說明這些因素對類胡蘿卜素提取率的影響極顯著；A（萃取壓力）的P值小于0.05，說明萃取壓力對類胡蘿卜素提取率的影響顯著。萃取壓力、萃取溫度、CO2流速和萃取時間4個因素對類胡蘿卜素提取率的影響由大到小依次為萃取溫度、萃取壓力、萃取時間、CO2流速。

為了更直觀地表現兩個因素同時對萃取煙葉中類胡蘿卜素量的影響，以任意兩因素為考查對象，剩余兩因素水平值取零進行降維分析，得到二元二次方程，繪出響應面圖（圖5～圖7）。因為等高線的形狀反映其交互效應的強弱大小，橢圓形表示兩個因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[7]。由圖5～圖7可知，萃取壓力和CO2流速的交互作用對煙葉中類胡蘿卜素提取率的影響最大。

對回歸模型進行響應面規范分析，尋求穩定值及最優條件，得到超臨界CO2法萃取煙葉中類胡蘿卜素的最優條件為萃取壓力23.53 MPa、萃取時間1.72 h、萃取溫度50.00 ℃、CO2流速8.05 L/h，理論上此條件下煙葉中類胡蘿卜素的提取率可達288.067 μg/100 g。

按響應面分析法求得的最佳條件進行驗證試驗，重復3次，得到煙葉中類胡蘿卜素的提取率平均值為285.1 μg/100 g，與理論值的偏差為1.04%。因此，利用響應面法優化得到的超臨界CO2法萃取煙葉中類胡蘿卜素的最佳工藝條件是可靠的。

3 結論

本試驗以煙葉中類胡蘿卜素提取率為指標，在單因素試驗研究的基礎上采用Box-Behnken響應面法對超臨界CO2萃取煙葉中類胡蘿卜素工藝的關鍵因素萃取壓力、萃取溫度、萃取時間和CO2流速進行了優化。結果表明萃取溫度、萃取壓力和CO2流速的交互作用對類胡蘿卜素提取率的影響極顯著；萃取壓力對類胡蘿卜素提取率的影響顯著。優化的萃取工藝條件為萃取壓力23.53 MPa、萃取時間為1.72 h、萃取溫度50.00 ℃、CO2流速8.05 L/h，此條件下煙葉中類胡蘿卜素的提取率為285.1 μg/100 g。

從廢棄煙草中提取類胡蘿卜素可以提高廢棄煙草的資源利用率，而且提取產物在卷煙加香減害方面有開發利用價值，可為解決目前低焦油卷煙所面臨的香氣不足的難題提供一種新的解決方案。

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