耐藥性甲型流感病毒H3N2神經氨酸酶免疫原性的研究

摘要：為了確定耐藥性甲型流感病毒H3N2神經氨酸酶的抗原性質較野生型甲型流感病毒是否發生改變，利用原核表達方法在大腸桿菌中大量表達并純化野生型甲型流感病毒H3N2的紅細胞凝集素（HA）和神經氨酸酶（NA）；取HA和NA免疫后的小鼠血清分別對野生型和突變型甲型流感病毒H3N2進行Western blotting、ELISA以及中和抗體檢測。結果表明，野生型甲型流感病毒以及第119位氨基酸單點突變型甲型流感病毒對HA和NA免疫后的小鼠血清都有很好的免疫反應性，而第222位氨基酸單點突變和雙點耐藥突變型甲型流感病毒對免疫血清的免疫反應性要低很多。該研究首次確定了甲型流感病毒H3N2的野毒株與耐藥突變株的神經氨酸酶的抗原性質存在很大的差異，進一步表明耐藥突變株病毒除了具有抗藥物活性之外也具有逃逸機體所產生的抗體攻擊的能力，可為將來新一代甲型流感病毒H3N2診斷試劑和疫苗的開發等進一步的研究提供重要參考。

關鍵詞：甲型流感病毒H3N2；耐藥性；神經氨酸酶；點突變；免疫原性

中圖分類號：R392.7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）03-0613-05

病毒通常會采用不同的策略來逃逸機體的免疫攻擊，因此研究病毒逃逸機制以及設計合理的方法來抑制病毒的逃逸，是目前疫苗研究的主要手段。其中病毒一個重要的逃逸機制就是遺傳突變，改變其自身表面主要抗原的空間表位，從而使機體免疫系統不再識別并產生作用，達到躲避機體免疫的目的[1-5]，使得免疫系統和疫苗無效，病毒得以大量繁殖。

甲型流感病毒H3N2表面有兩個主要的糖蛋白：紅細胞凝集素（Hemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（Neuraminidase，NA）。這兩個蛋白編碼基因都具有不同程度突變功能，通過引入新的突變，形成新的亞型病毒株來躲避機體免疫系統。HA通過結合細胞膜上的唾液酸受體從而介導病毒內吞進入細胞[6]。NA通過切割新生病毒和細胞多糖末端唾液酸，有利于新形成的子代病毒顆粒從感染細胞中釋放出去[7]，因此NA的抗體可以通過與NA特異性結合使NA的活性喪失，從而抑制新生甲型流感病毒的釋放，間接地達到中和甲型流感病毒的作用[8]。

目前，有臨床研究表明某些突變型甲型流感病毒H3N2具有抗奧司他韋的能力，發現其NA上的兩個關鍵的氨基酸位點（第119和222位氨基酸）對病毒的抗藥性起到了重要的作用，其中，第119位氨基酸由E突變為V， 而第222位氨基酸由Ⅰ突變成了L[9]，而且只有兩點同時突變的情況下才具有明顯的抗奧司他韋活性，但是不清楚該兩點的突變是病毒迫于藥物的壓力還是迫于機體免疫力（主要為病毒中和抗體）的攻擊而產生的。為了解釋這一問題，本試驗對病毒突變前后NA的抗原性質進行了比較，若病毒NA在突變前后抗原性質未發生改變，可以推測該突變是病毒迫于藥物的壓力而產生的；反之，則認為突變是病毒迫于機體免疫攻擊或是迫于藥物和機體免疫攻擊的總壓力而產生的。以上問題的闡明可為將來新一代甲型流感病毒H3N2診斷試劑和疫苗的開發等進一步的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因、質粒、菌株及毒株

野生型甲型流感病毒NA和HA截短型基因（均截去3′端150 bp）由吉林農業科技學院生物工程實驗室構建；原核表達載體pET-32a（+）、大腸桿菌BL21、DH5α為吉林農業科技學院生物工程實驗室保存；選用甲型流感病毒H3N2中國吉林流行株（GenBank：GU215036.1）為源病毒；NA第119位氨基酸單點突變、第222位氨基酸單點突變以及雙點突變型甲型流感病毒H3N2由吉林農業科技學院生物工程實驗室包裝并在MDCK細胞中傳代培養。

1.2 試劑

地高辛（NBT）和生物素（BCIP）購自北京鼎國公司；辣根過氧化物酶HRP標記抗鼠IgG購自晶美生物公司；堿性磷酸酶AP標記的抗鼠IgG購自中山生物科技有限公司；野生型甲型流感病毒HA和NA鼠源抗血清由吉林大學人獸共患病實驗室饋贈；蛋白Marker、質粒小提試劑盒等購自TaKaRa公司；Ni-NTA Agarose為Qiagen公司產品。

1.3 HA和NA截短型基因的原核表達及純化

誘導表達和表達產物的提取按Novagen公司的pET-32a表達系統操作手冊進行，由于HA和NA為包涵體表達，故用Ni-NTA Agarose按Qiagen公司說明書純化包涵體，PBS透析復性。

1.4 Western blotting法定性檢測HA和NA抗血清對野生型和突變型甲型流感病毒的免疫反應

將野生型和突變型甲型流感病毒液用蛋白裂解液裂解，煮沸變性15 min，12 000 r/min離心15 min后，取10 μL進行SDS-PAGE，電泳完畢后以15 V電壓轉膜23 min，以3%脫脂奶常溫封閉1 h后與相應的1∶1 000稀釋的一抗和二抗（AP標記） 進行常溫免疫雜交，分別作用2 h和1 h。最后以NBT和BCIP為底物顯色，進行Western blotting顯色。

1.5 間接ELISA法定量檢測HA和NA抗血清對野生型和突變型甲型流感病毒的免疫反應

將HA或NA抗原以10倍稀釋起始，2倍梯度，稀釋8個稀釋度并包被，野生型甲型流感病毒HA或NA抗血清以及陰性血清以20倍稀釋起始，2倍梯度，稀釋6個稀釋度，每孔均為100 μL，按間接ELISA方法進行操作。HRP標記的抗鼠IgG抗體以1∶5 000稀釋，每孔100 μL， 37 ℃孵育1 h，TMB避光顯色10 min，用2 mol/L硫酸終止反應。用酶標儀測各孔OD450 nm， 以陽性孔OD450 nm/陰性孔OD450 nm值最大的孔所對應的抗原包被濃度和血清稀釋濃度為最佳抗原包被濃度和血清稀釋濃度，并以此稀釋度下該孔的OD450 nm作為ELISA的最終結果。

1.6 中和抗體法功能性檢測HA和NA抗血清對野生型和突變型甲型流感病毒的中和能力

野生型甲型流感病毒HA和NA抗血清中和抗體委托吉林省疾病預防控制中心負責檢測，按照標準的甲型流感病毒中和抗體檢測方法進行操作。分別以野生型以及3種突變型甲型流感病毒H3N2作為感染病毒，每孔接毒100 TCID50；抗血清以8倍稀釋起始，2倍梯度稀釋，每孔100 μL，設復孔；病毒與抗血清37 ℃孵育1 h后接種到96孔板中（10 000個MDCK細胞/孔），連續5 d觀察細胞情況，以能夠抑制孔中一半的細胞發生病變時抗血清的最高稀釋度作為中和抗體的滴度值。

2 結果與分析

2.1 HA和NA截短型基因的原核表達及產物純化結果

以截短型HA和NA（3′端截去150 bp）連接到pET-32a（+）載體中所形成的質粒，在大腸桿菌BL21中目的基因得到大量表達，用鎳柱純化后，經SDS-PAGE檢測，表明目的蛋白得到大量表達，大小位置正確，純度達到90%左右，所得蛋白濃度分別為2.8 mg/mL（HA）和5.5 mg/mL（NA）。

2.2 Western blotting定性檢測HA和NA抗血清對野生型和突變型甲型流感病毒的免疫反應結果

用HA和NA免疫小鼠后的多克隆抗血清對野生型和多種突變型的甲型流感病毒進行Western blotting檢測，結果（圖2）顯示，HA和NA抗血清都能夠檢測出野生型和突變型甲型流感病毒H3N2，條帶大小正確。其中HA抗血清檢測野生型和突變型甲型流感病毒所產生的條帶濃度相似，可以推測野生型和突變型甲型流感病毒表面的HA蛋白的免疫原性沒有發生改變；而NA抗血清檢測出來的結果顯示野生型與第119位單點突變型條帶濃度相差不大且最濃，第222位單點突變型次之，雙點突變型條帶濃度最低，推測第119位氨基酸的突變并沒有明顯改變流感病毒表面NA包膜蛋白的抗原表位，而第222位氨基酸可能是NA的一個重要的抗原決定簇位置。

2.3 間接ELISA法定量檢測HA和NA抗血清對野生型和突變型甲型流感病毒的免疫反應結果

間接ELISA法定量檢測結果顯示，抗原最佳包被濃度為0.438 μg/孔（HA，1∶640稀釋）和3.438 μg/孔（NA，1∶160稀釋），血清最佳稀釋度為1∶40，以OD450 nm≥0.30作為陽性臨界值。由表1可知，HA抗血清對于野生型和突變型甲型流感病毒HA都有很好的免疫反應性（OD450 nm為15左右）；而NA抗血清對野生型和第119位氨基酸單點突變型甲型流感病毒具有較好的免疫反應性（OD450 nm分別為7.378和5.644），對第222位氨基酸單點突變型和雙點突變型都不具有好的免疫反應性（OD450 nm分別為0.933和0.634），較野生型均顯著降低（P<0.05）。這說明第222位氨基酸是甲型流感病毒NA的一個重要的抗原決定簇，通過第222位氨基酸的突變（由I突變為L），能夠大大改變甲型流感病毒NA的主要抗原表位，從而達到使傳統抗血清無法識別NA的作用；而第119位氨基酸不是NA的主要抗原表位，故當再引入第119位氨基酸的突變（由E突變為V）時，NA抗原表位未能發生更大的改變。

2.4 中和抗體法功能性檢測HA和NA抗血清對野生型和突變型甲型流感病毒的中和能力結果

為了進一步在功能水平上確定NA抗原表位的改變是否加強病毒逃逸機體免疫系統（中和抗體）攻擊的能力，即機體中和抗體是否還具備阻止病毒感染靶細胞的能力，利用野生型和多種突變型甲型流感病毒H3N2分別對HA和NA抗血清進行體外中和抗體檢測，結果顯示，HA抗血清對于野生型和突變型甲型流感病毒都具有很好的中和能力（中和滴度為256）；而NA抗血清對野生型和第119位氨基酸單點突變型甲型流感病毒具有較好的中和能力（中和滴度為128），對第222位氨基酸單點突變型和雙點突變型都不具有好的中和能力，其中單點突變型的中和滴度為32，而雙點突變型的中和滴度只有16。這說明第222位氨基酸不但是甲型流感病毒NA的重要抗原決定簇的位置，而且還是機體中和抗體識別甲型流感病毒的一個重要靶標，通過第222位氨基酸的突變（由I突變為L），使機體中和抗體不能有效識別甲型流感病毒包膜蛋白NA，從而達到逃逸的目的，同時再加上第119位氨基酸的突變（由E突變為V），使得病毒的中和表位進一步改變并具備了很好的耐藥性。單獨的第119位氨基酸突變并不能明顯改變NA的中和表位。

3 小結與討論

甲型流感病毒通常采用包膜蛋白HA的高突變性來躲避機體免疫系統的攻擊，而NA相對比較保守，故研究者多將NA作為抗甲型流感病毒藥物的靶標[10-13]。自21世紀以來，由于大量抗流感藥物的使用（如奧司他韋和扎那米韋）[14-17]，也出現了很多NA的突變，導致耐藥性的產生。因此有必要研究某些NA的突變到底是由于機體免疫系統的壓力還是由于藥物的壓力產生的，該問題的闡明可為將來新一代甲型流感病毒H3N2診斷試劑和疫苗的開發等進一步的研究提供參考。

本研究利用HA和NA的多克隆抗血清，分別對野生型和耐藥突變型甲型流感病毒H3N2進行了一系列免疫學試驗，結果表明盡管NA具有多個點突變形式，但由于HA未發生點突變，故HA抗血清對所有檢測的甲型流感病毒都具有好的免疫反應性，這實際上是一種陽性對照，其結果與理論相符；而NA的突變則引起其抗原性質發生了較大的改變。本試驗中，第119位氨基酸的單點突變未能明顯改變NA的表位抗原，而第222位氨基酸單點突變能夠明顯改變NA抗原性質，當然再引入第119位氨基酸突變從理論上認為抗原性質不會發生變化，但本試驗結果表明兩點突變較第222位氨基酸單點突變其抗原性質的改變存在少量的提升，但不明顯。而由中和抗體檢測結果從功能上證明兩點突變較第222位氨基酸單點突變不僅其中和表位發生了大的改變，而且還使病毒具有了抗奧司他韋的功能。以上結果說明對于雙點突變耐藥性H3N2，其第222位氨基酸的突變可以推測為病毒是迫于機體免疫系統的壓力而產生的，故病毒通過將第222位氨基酸由I突變成L，大大改變其抗原表位，避免與抗體結合，從而躲避機體抗體的攻擊；而第119位氨基酸的再突變，可能是由于目前大量抗病毒藥物的使用，迫于此壓力，病毒不得不通過引入另一個突變，雖然該突變不改變NA表位，但它可與第222位氨基酸的突變結合，能夠打破藥物作用于病毒的活性區域，使得病毒又具有很好的耐藥性。

從機理上分析，第222位氨基酸對于NA抗原表位的形成起到重要作用的原因可能在于抗體多識別NA亞基暴露在病毒最表面的區域，而該區域又鄰近NA活性區域，并與甲型流感病毒329-403氨基酸區域相對，該區域幾乎包括了所有針對NA的單克隆抗體的結合位點，因此在第198、199、220、221和222位氨基酸的突變能夠有效降低抗體與該區域結合的能力[18-20]。由于第222位氨基酸在NA激活區與第178位氨基酸W形成了一個疏水核心，這個疏水核心位于唾液酸乙酰基群和甲基群中，正好是奧司他韋作用于NA活性區域的位點，雖然第119位氨基酸的點突變不能明顯改變NA的抗原性質，但它與第222位氨基酸突變的結合，使NA激活區空間發生了突破性改變，從而避免了與奧司他韋的結合，產生了對奧司他韋很顯著的抗藥性。

本試驗將HA和NA基因的3′端截去150 bp，但由于該區域并不是傳統認為的主要抗原決定簇位置，故截去并不影響其抗原表位，但能夠顯著增加蛋白的表達量；進行免疫試驗時，采用的是小鼠產生的中和抗體，由于不能真實模擬人體所產生的中和抗體，故本試驗還有待將來采用人體所產生的中和抗體進行完善，使得結論更加有說服力；本試驗未采用各種突變型的NA所產生的抗血清來對野生型和突變型甲型流感病毒進行免疫學試驗，故也存在一些缺陷，需要將來更進一步完善試驗體系來得出更加準確的結論。

4 結論

本研究首次確定了甲型流感病毒H3N2的野毒株與耐藥突變株的神經氨酸酶的抗原性質存在很大的差異，推測其中第222位氨基酸的突變是病毒迫于機體免疫壓力，通過改變NA抗原性質而產生的，而第119位氨基酸的突變是病毒迫于抗病毒藥物的大量使用而產生的，以上兩點的雙突變，使得病毒不僅具有抗藥物活性同時也具有逃逸機體所產生的抗體攻擊的能力，該研究可為將來新一代甲型流感病毒H3N2診斷試劑和疫苗的開發等進一步的研究提供重要參考。

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