依達拉奉預處理對兔肺缺血再灌注損傷后肺水腫的影響

[摘要] 目的 探討依達拉奉對兔肺缺血再灌注損傷后肺水腫的保護作用及可能機制。 方法 建立兔肺缺血再灌注動物模型。家兔40只，隨機分為4組。ED組和VC組分別給予依達拉奉和維生素C預處理；CO組行左肺缺血再灌注；SH組只開胸并帶套。各組在缺血1 h并再灌注2 h后分別檢測SOD、MDA、iNOS和eNOS。取部分左肺下葉，測量肺W/D、肺含水量和MPO。靜注伊文思藍，比較通透性。 結果 再灌注后ED組的SOD、eNOS高于VC組和CO組；ED組的MDA、iNOS、肺W/D、肺含水量、MPO及伊文思藍含量低于VC組和CO組。 結論 依達拉奉能減輕肺缺血再灌注損傷后肺水腫的程度，具有肺保護作用。

[關鍵詞] 依達拉奉；肺缺血再灌注損傷；肺水腫；兔

[中圖分類號] R96 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）01-0001-04

自從McCord[1]提出了缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion-injury，IRI）的概念以來，對各器官組織的缺血再灌注損傷的研究一直成為醫學領域的重點和難點。其中，肺IRI的重要原因之一就是氧自由基形成。依達拉奉是一種新型自由基清除劑，對腦、心臟、肢體等多種組織器官的IRI有保護作用。本研究擬通過建立兔肺IRI動物模型，觀察依達拉奉對肺IRI后肺水腫的減輕作用，探討其可能機制，并為臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

10～12周齡健康家兔40只，雌雄兼用，體重2.5～3.0 kg，由齊齊哈爾醫學院動物實驗中心提供。

1.2 主要材料

動物人工呼吸機（DW-2000型，上海嘉鵬）；生物機能實驗系統（成都泰盟）；電熱恒溫干燥箱（上海新諾）；臺式離心機（湖南湘儀）；血氣分析儀（美國IL公司GEM-premier 3000）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、誘導型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）試劑盒和髓過氧化物酶（myeloperoxidases，MPO）試劑盒（南京建成）；內皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）試劑盒（北京華耐特）；伊文思藍（evens blue）（上海滬宇）；依達拉奉（edaravone）注射液（昆明積大，國藥準字H20080466）；維生素C（vitamin C）注射液（哈藥集團三精制藥，國藥準字H23021170）。

1.3 動物模型制備及分組

經耳緣靜注25%烏拉坦進行麻醉。頸正中切開皮膚，游離氣管，作T型口，4.5F氣管插管并結扎固定，連接呼吸機行機械通氣，呼吸參數如下：頻率為30次/min，吸呼比為1：1，潮氣量為15 mL/kg，氧濃度為21%。穩定15 min后開始模型復制。生理鹽水（0.5 mL/min）持續靜滴；剪斷第3～6肋軟骨及腋后線肋骨以暴露左胸腔器官，切開左胸膜，斷其左下肺韌帶，游離肺門，以7-0線作為阻斷帶將左肺門套帶以備阻斷左肺門用；并行全身肝素化。

隨機分為4組（2組實驗組、1組對照組和1組假手術組），每組10只。依達拉奉組（ED組）：于呼氣末時阻斷左肺門造成左肺缺血狀態，1 h后松開阻斷帶，左肺恢復灌注并復張后觀察2 h；阻斷左肺門前5 min經股靜脈滴注依達拉奉（5 mg/kg），2 min內靜注完；維生素C組（VC組）：手術過程同ED組，阻斷左肺門前5 min經股靜脈滴注維生素C（0.5 g/kg），2 min內靜注完；對照組（CO組）：手術過程同ED組，不給予任何藥物；假手術組（SH組）：開胸后僅游離左肺門，不阻斷肺門，觀察3 h。各組術中自頸總動脈插管，用于監測生命體征和采血。

1.4 檢測指標

1.4.1 動脈pH值與靜脈血氧分壓（PvO2）測定 ED組、VC組和CO組在缺血前、再灌注30、60、90和120 min及SH組在其對應時間點上分別取頸總動脈血和左下肺靜脈血作血氣分析檢測靜脈血氧分壓（PvO2）與動脈血pH值。

1.4.2 血漿SOD、MDA、iNOS和eNOS值測定 ED組、VC組和CO組在缺血前、再灌注60和120 min及SH組在其對應時間點上取左下肺靜脈血檢測SOD、MDA、iNOS和eNOS，具體步驟按試劑盒要求進行；并測算各生化指標在缺血前與再灌注120 min后的差值，比較抗氧化效果。

1.4.3 肺濕干重比（W/D）與肺含水量測定 ED組、VC組和CO組在缺血1 h、再灌注2 h，SH組在開胸3 h于近肺門處結扎并切取部分左肺下葉相同部位組織約500 mg，計算肺濕干重比（W/D），并通過測量肺濕干重來計算肺含水量，檢測肺水腫情況：吸干肺表面水分后稱重，為濕重（W），置于70℃干燥箱中烘干3 d后稱干重（D），通過公式算出肺含水量。肺含水量=（濕重-干重）/濕重。

1.4.4 MPO含量測定 上述方法取部分左肺下葉凍存，采用比色法測定肺組織MPO含量，具體步驟按試劑盒要求進行。

1.4.5 伊文思藍含量測定 手術結束前，各組經股靜脈注射2%伊文思藍（1.5 mL/kg），然后取左肺上葉約200～350 mg，吸干血液，配伍比例為每100 mg濕重組織：2 mL甲酰胺，置入45℃水浴中，抽提離心后于波長632 nm處測吸光度，算出伊文思藍含量，比較肺血管通透性。

1.5 統計學處理

采用SPSS 15.0統計學軟件進行ANOVA方差分析。實驗數據采用均數±標準差（x±s）表示，各組計量資料采用t檢驗，并進行LSD檢驗作兩兩比較。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動脈pH值與靜脈血氧分壓（PvO2）測定結果

各組在缺血再灌注前pH值和PvO2值差異無統計學意義，見表1。除SH組外，其他三組再灌注后各時點的pH值和PvO2值均低于缺血前值（P < 0.05）；但ED組的pH值下降至7.094±0.041，均高于VC組（7.001±0.086）和CO組（7.053±0.037）（P < 0.05），除再灌注30 min外，ED組的PvO2值下降至74.37±6.29，均高于VC組（69.10±5.71）和CO組（66.07±6.15）（P < 0.05）。見圖1，表2。

2.2 血漿SOD、MDA、iNOS和eNOS值測定結果

缺血前，各組血漿SOD、MDA、iNOS和eNOS值差異無統計學意義，見表1。除SH外，其他三組再灌注后各時點MDA、iNOS值高于缺血前（P < 0.05），但ED組分別升高至189.55±8.78、105.04±8.72，均低于VC組（216.25±12.56、128.90±14.46）和CO組（231.56±17.05、164.62±13.57）（P < 0.05）；而其他三組再灌注后各時點SOD、eNOS值低于缺血前（P < 0.05），但ED組分別下降至347.53±18.78、296.90±13.06，均高于VC組（326.15±15.04、284.87±16.26）和CO組（298.39±16.76、257.80±15.48）（P < 0.05）。見圖2，表3。

2.3 肺濕干重比（W/D）與肺含水量、MPO含量及伊文思藍含量測定結果

ED組、VC組及CO組的左肺W/D與含水量、MPO含量及伊文思藍含量均明顯高于SH組（3.83±0.50、4.38±0.42、0.56±0.51、106.06±5.16）（P < 0.05），但ED組的左肺W/D與含水量（5.18±0.46、5.67±0.38）、MPO含量（0.82±0.45）及伊文思藍含量（127.31±5.31）則明顯低于VC組（6.88±0.44、6.51±0.39、1.15±0.57、165.24±6.20）及CO組（7.26±0.48、6.86±0.44、1.19±0.53、170.97±5.64）（P < 0.05）。見表4。

3 討論

目前，缺血再灌注損傷（IRI）的發病機制尚未完全闡明，這可能是多因素相互作用的結果。它們包括氧自由基（oxygen free radicals，OFR）生成、ATP生成減少、鈣超載、白細胞作用等[2]。目前，OFR在IRI中的作用得到較高的重視。

在常態下，體內存在清除和抑制自由基反應的酶系統，如SOD等，使其OFR的生成與清除處于動態平衡，防止自由基損傷。當肺缺血再灌注損傷時，可大量產生自由基，造成氧化/抗氧化系統之間的失衡，引起生物膜發生過氧化反應，造成多種細胞器結構的破壞（如細胞膜），導致肺泡及肺血管細胞的損傷，致使肺水腫。因此，應用抗氧化劑清除OFR是減輕肺缺血再灌注損傷的關鍵之一。

近年來，常用的抗氧化劑包括維生素C和輔酶Q10[3]等，它們主要通過抑制花生四烯酸脂氧合酶途徑[4]起到清除OFR的作用，而研究發現依達拉奉作為一種新型自由基清除劑，除上述途徑外，尚能有效清除羥自由基（·OH）[5]。另外，此藥具有親脂性和經靜脈給予后可保持有效的藥物水平等良好的藥理性質[6]，故具有比傳統抗氧化劑更強的抑制過氧化反應效果?，F已有實驗應用依達拉奉來抑制腦組織、心臟、肝臟[7-9]等臟器IRI的研究。

SOD的活性變化可間接反映機體清除自由基的能力[10]；而MDA是脂質過氧化作用產物，其含量可反映機體和細胞的氧化損傷程度[11]。本研究在兔肺缺血再灌注前分別給予依達拉奉和維生素C（作為對比劑）預處理，其結果顯示，除SH組外，其他三組再灌注后各時點SOD低于缺血前，但ED組均高于同時點的VC組和CO組，但再灌注后各時點MDA高于缺血前，但ED組明顯低于同時點的VC組和CO組；并且抗氧化效果示：ED組SOD活性下降明顯低于其他兩組；MDA含量上升也明顯低于其他兩組；提示依達拉奉可明顯加強SOD表達，減少MDA含量，以提高機體清除OFR的能力，保護肺泡及肺血管細胞，減輕肺缺血再灌注損傷。

一氧化氮（NO）是具有神經毒性的自由基，體內NO的含量及作用依賴于一氧化氮合酶（NOS）的活性。NOS有三種亞型。肺內的NOS主要是內皮型（eNOS）與誘導型（iNOS）。在常態下，只有eNOS處于催化合成NO的狀態，表達出低濃度且恒定的NO，在肺保護方面起重要作用。iNOS在常態下極少表達，但在某些病理情況下（如缺血、缺氧等）表達明顯增強，生成大量NO，導致全身性炎癥反應上調并參與后期器官的損傷[12]。故肺IRI時，導致炎癥性NO合成大量增加而保護性NO合成迅速減少，是肺IRI的重要機制之一[12]。本研究結果表明，除SH組外，其他三組再灌注后各時點eNOS值低于缺血前，但ED組均高于同時點的VC組和CO組；而再灌注后各時點iNOS值高于缺血前，但ED組明顯低于同時點的VC組和CO組；并且抗氧化效果示：ED組eNOS的表達下降及iNOS的表達上升都明顯低于VC組和CO組，說明依達拉奉可能通過有效促進eNOS表達，增加了保護性NO合成，并且抑制iNOS表達以減少炎癥性NO合成，從而保護肺功能。

另外，中性粒細胞可大量生成并釋放多種炎性介質而導致微血管損傷也是IRI的主要機制之一[13]。研究表明，肺經歷缺血再灌注后，中性粒細胞的炎性作用可增高微血管的通透性，形成細胞間質水腫，導致肺含水量增多，是降低肺功能的主因之一[14]。本研究結果顯示，ED組、VC組及CO組的家兔肺組織經歷缺血再灌注后與SH組相比，其左肺W/D與含水量均明顯升高，提示肺缺血再灌注后可致肺水腫，但ED組與VC組及CO相比，兩指標則明顯降低，說明依達拉奉具有減輕肺IRI后肺水腫的作用。

對中性粒細胞所釋放的MPO進行分析可間接分析其數量[15]，也可發現中性粒細胞是否浸潤。本研究發現ED組、VC組及CO組的MPO含量均明顯高于SH組，而ED組該酶含量明顯低于其他兩組，該結果也證實了依達拉奉具有減輕肺水腫的作用。同時，又比較各組左肺的血管通透性，其結果表明，ED組、VC組及CO組靜注伊文思藍后其肺內含量均明顯高于SH組，但ED組的伊文思藍含量明顯低于其他兩組，結果說明經依達拉奉預處理的ED組明顯改善了肺血管通透性。

綜上所述，依達拉奉可明顯提高SOD活性，減少MDA產生，降低肺組織內MPO含量、肺組織W/D和含水量。其可能機制為：通過增強OFR清除能力，抑制脂質過氧化反應，從而減輕肺組織細胞的損傷，增強eNOS表達，抑制iNOS表達，減輕炎癥反應，改善血管通透性，減輕肺組織損傷，達到保護肺缺血再灌注引起的肺水腫的目的。本研究也存在一定的局限性，如樣本數量較小，其遠期作用尚不明確等。確切結論有待進一步大樣本、多中心的研究。

[參考文獻]

[1] McCord JM. Oxygen-derived free radicals in postischemiatissue injury[J]. N Engl J Med，1985，312（3）：159-163.

[2] Tapuria N，Kumar Y，Habib MM，et al. Remote ischemic preconditioning： a novel protective method from ischemia reperfusion injury-a review[J]. J Surg Res，2008，150（2）：304-330.

[3] Kishimoto C，Tomika N，Nakayama Y，et al. Anti-oxidant effects of coenzyme Q10 on experimental viral myocarditis in mice[J]. Cardiovasc Pharmacol，2003，42（5）：588-592.

[4] Yanagisawa A，Miyagawa M，Ishikawa K，et al. Cardioprotective effect of MCI-186 （3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one） during acute ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Int J Angiol，1994，3：12-15.

[5] Onogi H，Minatoguchi S，Chen XH，et al. Edaravone reducesmyocardial infarct size and improves cardiac fun ction and remodelling in rabbits[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol，2006，33（11）：1035-1041.

[6] Minhaz U，Tanaka M，Tsukamoto H，et al. Effect of MCI-186 on postischemic reperfusion injury in isolated rat heart[J]. Free Radic Res，1996， 24：361-367.

[7] 梅利，吳世政. 依達拉奉預處理對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護機制[J]. 臨床神經病學雜志，2011，24（4）：36-38.

[8] 戴閩，劉靜，吳屹. 依達拉奉在鼠氧自由基心肌損害和人病毒性心肌炎中的抗氧化作用研究[J]. 西南軍醫，2010，12（2）：230-232.

[9] Abe T，Unno M，Takeuchi H，et al. A new free radical scavenger， edaravone， ameliorates oxidative liver dam age due to ischemia-reperfusion in vitro and in vivo[J]. J Gastrointest Surg，2004，8（5）：604-615.

[10] 朱述陽，何冰，穆魁敏，等. 氧自由基在兔肺缺血再灌注損傷發生中的作用[J]. 中華醫學雜志，1992，72（6）：370-371.

[11] Lkizler M，Ovali C，Dernek S，et al. Protective effects of resveratrol in ischemia-reperfusion injury of skeletal muscle： A clinically relevant animal model for lower extremity ischemia[J]. Chin J Physiol，2006，49（4）：204-209.

[12] Cardella JA，Keshavjce SH，Bai XH，et al. Increased expression of nitric oxide synthase in human lung transplants after nitric oxide inhalation[J]. Transplantation，2004，77（2）：886-890.

[13] Van der Kaaij NP，Kluin J，Haitsma JJ，et al. Ischemia of the lung causes extensive long-term pulmonary injury： an experimental study[J].Respir Res，2008，9（1）：28.

[14] de Perrot M，Liu M，Waddell TK，et al. Ischemia-reperfusion-induced lung injury[J]. Am J Respir Crit Care Med，2003，167（4）：490-511.

[15] Lu YT，Hellewell PG，Evans TW，et al. Ischemia-reperfusion lung injury： contribution of ischemia， neutrohils and hydrostatic pressure[J].Am J Physiol，1997，273（1 Pt 1）：46-54.

（收稿日期：2012-10-15）