糖尿病患者結合珠蛋白基因多態性與冠脈狹窄相關性研究

[摘要] 目的 探討糖尿病患者結合珠蛋白基因多態性與冠狀動脈狹窄嚴重程度的相關性。 方法 選擇98例糖尿病合并冠心病患者以及77例單純糖尿病患者，采用PCR-SSP技術檢測結合珠蛋白基因型，據此對糖尿病合并冠心病患者進行分組，采用Gensini冠狀動脈評分系統（Gensini積分）對冠狀動脈的狹窄程度進行評分。 結果 糖尿病合并冠心病組Hp基因型分布與單純糖尿病組相比差異有統計學意義，表現為Hp2-2基因型在糖尿病合并冠心病組的頻率明顯高于單純糖尿病組（0.55 vs 0.35，P < 0.05）。糖尿病合并冠心病組間，Hp2-2基因型組的Gensini 積分明顯高于Hp1-1/Hp1-2 基因型組（P < 0.05）。 結論 Hp2-2基因型可能與糖尿病患者冠心病的發生相關，且與糖尿病患者冠脈狹窄的嚴重程度相關。

[關鍵詞] 糖尿病；結合珠蛋白（Hp）；基因多態性；冠狀動脈狹窄

[中圖分類號] R541.4 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）01-0030-03

糖尿病已經成為動脈粥樣硬化和冠心病最重要的危險因子，氧化應激和炎癥反應在動脈粥樣硬化過程中有重要作用。研究顯示動脈粥樣硬化的發生與基因的多態性有關[1，2]。結合珠蛋白（Haptoglobin，Hp）又稱觸珠蛋白，是一種酸性糖蛋白，屬急性期反應蛋白之一，具有抗氧化活性、抑制前列腺素合成、促進血管生成及調節機體免疫等功能[3]。人類Hp基因位于染色體16q22.1，存在基因多態性，表現為Hp1-1、Hp1-2和Hp2-2三種基因型[4]。國外研究發現Hp2-2基因型是糖尿病患者心血管并發癥出現的獨立危險因子，Hp2-2基因型的糖尿病患者更容易出現心血管并發癥。本研究采用PCR-SSP技術檢測結合珠蛋白基因型，采用Gensini積分對冠狀動脈的狹窄程度進行評分，探討糖尿病患者結合珠蛋白基因多態性與冠心病的發生及冠脈狹窄嚴重程度的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年5月～2011年1月青島市市立醫院西院心內科經過冠脈造影確診的98例糖尿病合并冠心病患者，其中男60例，女38例，年齡47～77歲，平均（57.72±9.95）歲，以及同期經冠脈造影或冠脈CTA檢查排除冠心病的77例單純糖尿病患者，其中男48例，女29例，年齡48～76歲，平均（58.64±10.14）歲。糖尿病診斷符合1999年WHO糖尿病診斷標準。

1.1.1 采用Judkins法行選擇性冠脈造影檢查 每支冠狀動脈均經多體位投照。冠心病的診斷根據臨床表現結合冠脈造影結果，至少1支冠脈血管狹窄>50%確診為冠心病。采用Gensini 冠狀動脈評分系統（Gensini 積分）對冠脈的狹窄程度進行評分。根據冠脈造影結果，將冠脈分成14段，狹窄程度以最嚴重處為標準：狹窄直徑≤25%記1分，狹窄直徑25%～50%記2分，狹窄直徑51%～75%記4分，狹窄直徑76%～90%記8分，狹窄直徑91%～99%記16分，狹窄直徑100%記32分。病變血管不同節段權重系數：左主干×5，前降支近段×2.5，前降支中段×1.5，前降支遠段×1，回旋支近段×2.5（開口處×3.5），回旋支遠段、鈍緣支、右冠狀動脈、后降支及第1對角支均×1，第2對角支及后側支×0.5。

1.1.2 排除標準 所有對象均做血常規、肝腎功、血脂、血糖、糖化血紅蛋白、12導聯心電圖、胸片、心臟彩超，除外既往經皮冠狀動脈成形術或冠脈旁路移植術、心臟瓣膜病、結締組織病、惡性腫瘤、肝腎功能不全、嚴重創傷、手術或感染。半月內服用過他汀類調脂藥、非甾體類消炎藥、抗生素等藥物的患者，均不能入選本研究。

1.2 Hp基因型的檢測

采集受試者的靜脈血2 mL，EDTA抗凝，置于離心機內以1 800 rpm離心10 min，分離出血漿。用天根公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒提取受試者血液DNA。參考Werner Koch[3]對Hp基因分型的PCR實驗方法進行分型檢測。用引物A和B擴增Hp1特異性的1 757 bp片段，用引物C和D擴增Hp2特異性的349 bp片段。上游引物A：5’-GAGGGGAGCTTGCCTTTCCATTG-3’，下游引物B：5’-GAGATTTTTGAGCCCTGGCTGGT-3’，上游引物C：5’-CCTG-CCTCGTATTAACTGCACCAT-3’，下游引物D：5’-CCGAGTGCTCCACATAGCCATGT-3’。PCR反應體系為模板DNA 5 μL，10×Tap plus Buffer（with MgCl2）2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，Tap plus DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.5 μL，加入ddH2O補至25 μL體系。擴增條件：95℃預變性2 min，95℃變性1 min，69℃退火和延伸2 min（A和B擴增時）或1 min（C和D擴增時），共35個循環后72℃終末延伸7 min。PCR產物以1%的瓊脂糖凝膠電泳，經125 V 30 min，在紫外光下觀察，攝影。

1.3 統計學處理

采用SPSS 15.0 統計軟件分析。以均數±標準差（x±s）表示，計量資料組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數資料采用χ2檢驗。所有統計學分析及雙側概率以P < 0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hp基因型分型結果

如圖1所示，條帶1、3、5為引物A、B擴增產物，其中750 bp經測序為B引物單獨擴增序列，不影響結合珠蛋白基因分型，條帶1、3含1 757 bp為Hp1等位基因擴增產物；條帶2、4、6為引物C、D擴增產物，條帶4、6含349 bp為Hp2等位基因擴增產物。Hp1-1基因型顯示條帶1、2；Hp1-2基因型顯示條帶3、4；Hp2-2基因型顯示條帶5、6。

2.2 兩組一般資料比較

兩組患者一般臨床資料比較，性別、年齡、總膽固醇、低密度脂蛋白、糖化血紅蛋白均無統計學差異（P > 0.05），見表1。

2.3 兩組Hp2-2基因型頻率比較

兩組的Hp2-2基因型出現頻率分別為0.55 vs 0.35，P < 0.05，兩組間Hp基因型分布有統計學差異，表現為Hp2-2基因型在糖尿病合并冠心病組的頻率明顯高于單純糖尿病組。見表2。

糖尿病合并冠心病組間，Hp2-2基因型組（n = 54）的Gensini積分（87.72±36.460），Hp1-1/Hp1-2 基因型組（n = 44）的Gensini積分（57.16±25.432），Hp2-2基因型組的Gensini 積分明顯高于Hp1-1/Hp1-2基因型組（P < 0.05）。

3 討論

氧化應激和炎癥反應在動脈粥樣硬化過程中扮有重要作用，Hp屬炎性反應急性期反應蛋白之一，其主要功能是通過與游離血紅蛋白結合形成Hp-Hb復合物，防止過量Hb對組織的氧化損傷，并阻止Hb從腎小球濾過，避免Hb對腎小管的損害及機體鐵質的丟失。Hp可能與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關[5]。人類Hp存在基因多態性，表現為三種基因型Hp1-1、Hp2-1和Hp2-2。

心血管病的發病、預后是否與Hp的基因型有關一直存有爭議。國外很多大規模臨床實驗表明：Hp基因型雖與糖尿病的發病沒有關系，但與糖尿病患者心血管并發癥的出現有密切聯系，研究發現，Hp2-2基因型與糖尿病小鼠心梗后的死亡率及更嚴重的心血管重構有關[6]，Hp2-2基因型是糖尿病患者心血管并發癥出現的獨立危險因子，Hp2-2型糖尿病患者發生冠心病的機率是其它表型（Hp1-1和Hp2-1）的2～5倍[7]。Suleiman M等對1 437例發生心肌梗死患者發病30 d的死亡率和心衰率進行研究發現，Hp2-2型糖尿病患者的心梗面積明顯比較大，其心梗死亡率和心衰率是Hp1-1型糖尿病患者的8倍[8]。

研究顯示，Hp2-2基因型頻率在糖尿病合并冠心病組明顯高于單純糖尿病組（0.55 vs 0.35，P < 0.05），在糖尿病合并冠心病組間，Hp2-2基因型組的Gensini積分明顯高于Hp1-1/Hp1-2 基因型組（P < 0.05），提示Hp2-2基因型可能與糖尿病患者冠心病的發生相關，Hp2-2 基因型可能與糖尿病患者冠狀動脈狹窄的嚴重程度相關。這個結果與上述的研究結果一致。可能機制為：①不同基因型Hp其結構不同，抗氧化劑活性不同， Hp1-1基因型與其他型別相比具有更強的抗氧化活性[9]。②在糖尿病的病理狀況下，Hp的抗氧化能力被削弱，Hp2-2基因型與Hp1-1基因型個體間抗氧化應激的差別被進一步放大[10]，導致Hp2-2基因型糖尿病患者體內的氧化應激狀態普遍比Hp1-1基因型的糖尿病患者高。Asleh等[11]研究亦表明，Hp與糖基化的Hb結合后較與非糖基化的Hb結合其抗氧化功能明顯減弱，故可能使氧化修飾的低密度脂蛋白增加對動脈內膜造成損傷導致冠心病的發生。

綜上所述，Hp2-2基因型可能與糖尿病患者冠心病的發生密切相關，可能與冠狀動脈狹窄的嚴重程度相關。對于Hp2-2型的糖尿病患者來說，適當地補充抗氧化劑例如維生素E，可以對抗心血管并發癥的發生發展，根椐Hp基因型對糖尿病合并冠心病患者開展個性化抗氧化治療具有可行性。

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（收稿日期：2012-10-19）