依托泊苷聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響

[摘要] 目的 探討依托泊苷聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞增殖和凋亡的影響，為骨肉瘤的治療找尋新的化療方法。 方法 采用MTT法檢測藥物對骨肉瘤細胞增殖的影響。倒置相差顯微鏡來觀察用藥前后細胞形態(tài)改變，用流式細胞儀檢測藥物分別及聯(lián)合作用骨肉瘤細胞后細胞凋亡情況。 結(jié)果 依托泊苷聯(lián)合順鉑能明顯抑制骨肉瘤細胞的生長，與兩藥單獨使用相比較，聯(lián)合用藥抑制骨肉瘤細胞增殖的作用明顯增強。依托泊苷聯(lián)合順鉑作用于骨肉瘤細胞后凋亡率增高。倒置相差顯微鏡可見兩藥聯(lián)用時大量骨肉瘤細胞凋亡脫落。 結(jié)論 依托泊苷聯(lián)合順鉑能有效抑制骨肉瘤細胞增殖，且促進骨肉瘤細胞凋亡，具有協(xié)同抗腫瘤作用。

[關(guān)鍵詞] 骨肉瘤細胞；依托泊苷；順鉑

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）01-37-03

骨肉瘤發(fā)病率在骨原發(fā)性惡性腫瘤中占據(jù)首位，常見于兒童和青少年。該瘤惡性程度甚高，預后差。化療能明顯提高骨肉瘤患者的生存率，其重要性越來越受到臨床治療的關(guān)注。目前治療骨肉瘤的化療藥物很多，但由于藥物的耐藥性，單用一種化療藥對骨肉瘤的治療作用不甚理想。依托泊苷是鬼臼毒素的半合成衍生物，屬細胞周期特異性藥物，作用于晚S期及G2期。該藥是一種廣譜抗腫瘤藥物，是目前骨肉瘤化療藥物研究的熱點[1-2]。本實驗將依托泊苷和常用骨肉瘤化療藥物順鉑單獨或者聯(lián)合作用于骨肉瘤細胞，觀察其作用效果，來尋找安全有效的聯(lián)合用藥方案，為骨肉瘤的臨床治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞培養(yǎng)：人骨肉瘤細胞株MG-63（南京凱基），含

10%小牛血清（杭州四季青）1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。主要試劑：依托泊苷注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，H32025583）；注射用順鉑（山東齊魯制藥有限公司，H37021358）；凱基AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基）；96孔板（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；流式細胞儀型號：EPICS ALTRAⅡ（American Beckman）；KDC-40低速離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；CF-板式酶標儀（北京市新風機電技術(shù)公司）；YJ-875型超凈化工作臺（蘇州凈化設備廠）；二氧化碳細胞恒溫培養(yǎng)箱（HF90，香港）；倒置顯微鏡（CKX41SF，日本奧林巴斯公司）

1.2 細胞培養(yǎng)

將人骨肉瘤細胞MG-63置于含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，放入37℃，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代備用。

1.3 MTT法檢測藥物對骨肉瘤細胞增殖的影響

將傳代穩(wěn)定后的骨肉瘤細胞制成1×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔體積為100μL。把接種好的96孔板放入37℃、5% CO2及飽和濕度條件下的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞貼壁后，將不同濃度的藥物單獨或者兩藥聯(lián)合加入各孔中，每組設3個復孔。按照梁承偉等[1，3]報道選擇兩藥最適濃度，設對照組及實驗組。對照組：依托泊苷和順鉑的濃度均為0μg/mL。實驗組：依托泊苷組濃度設為1、2、4μg/mL，順鉑組濃度設為2、4、8μg/mL，兩藥聯(lián)合組為兩藥濃度的組合。培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20μL，37℃繼續(xù)孵育4 h之后棄去上清液，每孔加二甲基亞楓（DMSO）150μL，用平板搖床搖10 min后，選擇490 nm波長，使用酶標儀測定吸光度（A值）。并計算細胞殺傷率。細胞殺傷率（%）=（1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%

1.4 倒置相差顯微觀察

倒置相差顯微鏡觀察用藥前后骨肉瘤細胞的數(shù)目、貼壁情況、生長狀況及形態(tài)學改變。

1.5 流式細胞儀分析

兩藥單獨及聯(lián)合處理的骨肉瘤細胞，按照梁承偉等[1，3]，選擇最佳藥物濃度。1 000 rmp，離心5 min收集1×106細胞，用PBS洗滌細胞2次。加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5μL Annexin V-FITC混勻，之后加入5μL碘化丙啶混勻，避光反應5～15 min，用流式細胞儀檢測。Cell Quest軟件進行數(shù)據(jù)分析

1.6 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析用SPSS17.0軟件包，實驗數(shù)據(jù)以（）表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測藥物對骨肉瘤細胞增殖的影響

與兩藥單獨使用相比較，聯(lián)合用藥更能夠有效抑制骨肉瘤細胞增殖，且骨肉瘤細胞增殖抑制率與藥物濃度和作用時間呈正比，在一定范圍內(nèi)，隨著時間和藥物濃度的增加，骨肉瘤的細胞增殖抑制率也相應增加。見表1。

2.2 倒置相差顯微鏡觀察

在倒置相差顯微鏡下，空白對照組細胞呈多角形，核圓，細胞貼壁生長良好（圖1）。單用依托泊苷及順鉑時細胞形態(tài)呈不規(guī)則，表現(xiàn)出不同程度的細胞皺縮，邊緣毛糙，部分細胞的染色質(zhì)固縮，聚集于細胞核的邊緣，胞漿濃縮。少量細胞脫落呈圓形，懸浮于培養(yǎng)液中（圖2、3）。兩藥聯(lián)用時可見大量細胞凋亡脫落且懸浮于培養(yǎng)液中，只剩少數(shù)形態(tài)不規(guī)則細胞貼壁（圖4）。

2.3 流式細胞儀分析

依托泊苷聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞凋亡作用的研究結(jié)果顯示：依托泊苷和順鉑兩藥單獨使用均可誘導骨肉瘤細胞凋亡（P<0.05），而兩藥聯(lián)合使用，誘導細胞凋亡的作用明顯增強（P<0.05）。見表2。

3 結(jié)論

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是源于間葉組織的惡性腫瘤，以能產(chǎn)生骨樣組織的梭形基質(zhì)細胞為特征，75%的患者年齡在10～30歲，是嚴重影響青壯年身心健康的惡性疾病。新輔助化療的應用明顯提高了骨肉瘤患者的生存率及保肢成功率，術(shù)前化療-手術(shù)-術(shù)后化療的方式已廣泛應用于骨肉瘤治療[4]。

目前治療骨肉瘤的化療藥物很多，但由于藥物的毒性和耐藥性，單用一種化療藥對骨肉瘤很難見效。依托泊苷中文別名鬼臼乙叉甙，是細胞周期特異性抗腫瘤藥物，作用于晚S期或G2期，其作用位點是拓撲異構(gòu)酶Ⅱ，形成一種藥物-酶-DNA三者之間穩(wěn)定的可裂性復合物，干擾DNA拓樸異構(gòu)酶Ⅱ（DNA topoisomeraseⅡ），致使受損的DNA不能修復，導致腫瘤細胞凋亡[5-6]。順鉑是骨肉瘤化療的常用藥物之一，其殺傷腫瘤細胞的作用強，活性高，且毒譜與其他化療藥物也有所不同，順鉑為鉑的金屬絡合物，作用似烷化劑，主要作用靶點為DNA，作用于DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈，形成DDP～DNA復合物，干擾DNA復制，或與核蛋白及胞漿蛋白結(jié)合。屬細胞周期非特異性藥。具有細胞毒性，有較強的廣譜抗癌作用。與多種化療藥物都有協(xié)同作用。很多國內(nèi)外有關(guān)文獻報道認為含有順鉑的聯(lián)合化療方案治療骨肉瘤較為理想[7]。但由于順鉑日漸突出的毒性和耐藥性問題，使其臨床療效也受到影響。選擇聯(lián)合用藥，提高化療敏感度，是提高骨肉瘤治愈率的有效措施[3]。

本實驗將依托泊苷與順鉑聯(lián)合，一同作用于體外培養(yǎng)的骨肉瘤細胞，試驗通過MTT、細胞形態(tài)學觀察，流式細胞術(shù)等對藥物處理的骨肉瘤細胞進行了檢測。MTT實驗證明細胞殺傷率與藥物濃度和作用時間均呈正比，在一定范圍內(nèi)，有明顯的劑量時間依賴性，與兩藥單獨使用相比較，聯(lián)合用藥更能夠有效抑制骨肉瘤細胞增殖。在倒置相差顯微鏡下觀察，空白對照組細胞呈多角形，核圓，細胞貼壁生長良好。單用依托泊苷及順鉑時細胞形態(tài)呈不規(guī)則，表現(xiàn)出不同程度的細胞皺縮，邊緣毛糙，部分細胞的染色質(zhì)固縮，聚集于細胞核的邊緣，胞漿濃縮，少量細胞脫落呈圓形，懸浮于培養(yǎng)液中。兩藥聯(lián)用時可見大量細胞凋亡脫落且懸浮于培養(yǎng)液中，只剩少數(shù)形態(tài)不規(guī)則的細胞貼壁。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示依托泊苷和順鉑單獨使用均可誘導骨肉瘤細胞凋亡（P<0.05），兩藥聯(lián)合使用，誘導細胞凋亡的作用明顯增強（P<0.05）。Yan等[8-9]研究表明，化療藥物主要通過誘導癌細胞的凋亡達到治療目的，癌細胞對化療藥物的敏感性決定了抗癌的有效性，化療藥物誘導癌細胞凋亡的能力被視為評估療效的一項指標。依托泊苷和順鉑聯(lián)用的化療作用有可能是通過促進骨肉瘤細胞凋亡而實現(xiàn)的。

實驗表明依托泊苷與順鉑協(xié)同作用可以顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖，促進其凋亡。筆者相信依托泊苷和順鉑聯(lián)合用藥的化療方案會有廣闊的臨床應用前景。但由于人體三維結(jié)構(gòu)比較體外細胞培養(yǎng)的復雜性以及腫瘤的異質(zhì)性。現(xiàn)在還只能從體外實驗的角度來證明聯(lián)合應用順鉑和依托泊苷可有更明顯的細胞毒性作用，可以為臨床應用提供理論依據(jù)，但更進一步的結(jié)果尚需深入研究，為骨肉瘤治療提出新的化療方案。

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（收稿日期：2012-11-19）