人卵巢腺癌原位移植與皮下種植裸小鼠模型的對比研究

[摘要] 目的 建立人卵巢腺癌裸小鼠皮下和原位移植瘤及其自發轉移瘤模型，比較其生物學特性。 方法 利用高轉移卵巢腺癌細胞株HO8910先制備裸小鼠皮下種植瘤模型，然后將瘤組織運用顯微外科的方法植入裸鼠右側卵巢包膜內，原位移植成功后繼續在鼠間卵巢包膜內傳代，用組織病理學、電鏡及染色體核型分析驗證模型，并比較2種模型在生物學特性上的差異。 結果 小鼠皮下與卵巢原位成瘤率均為100%（分別為3/3和10/10），原位移植瘤轉移率為50%，轉移開始出現時間2周。卵巢包膜間傳代，平均第2～4代出現卵巢癌的臟器轉移。2 組荷瘤鼠中位生存時間分別為（28.000±1.095）d 和（40.000±0.894）d，差異有統計學意義（P<0.05）；2種模型的組織形態和超微結構類似，均顯示人類染色體的特點；免疫組化均表達 CA125、CK抗體。 結論 2種模型均展現了人卵巢腺癌的生物學特點，其中原位移植瘤模型是研究卵巢腺癌的良好平臺和抗癌藥物篩選更客觀的模型。

[關鍵詞] 裸小鼠；疾病模型；卵巢腺癌；移植

[中圖分類號] R735.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）01-26-03

卵巢腺癌動物模型常應用于在體卵巢癌的發生發展和發病機制和藥物應用研究。目前常用的主要有皮下移植瘤、腹水瘤及原位移植瘤模型[1]。

原位移植瘤模型以其高仿真度、客觀真實地再現卵巢癌的發生、發展過程而備受研究者青睞，國外已廣泛應用于腫瘤轉移和藥物篩選的研究[2]。本研究從卵巢癌的原位移植入手，構架自發轉移瘤模型，并與皮下移植瘤模型進行比較。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/C-nunu雌性裸小鼠，體重（20±2）g/只，5～7周齡，由廣東省醫學實驗動物中心提供，合格證號[SCXK（粵）2008-0002]，在SPF條件下飼養。

1.2 材料

1.2.1 細胞株 高侵襲性人卵巢腺癌HO8910細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.2.2 主要試劑 秋水仙素、胰島素（Sigma）；胰酶、膠原酶、標準胎牛血清及DMEM-培養基（Gibco）；一抗鼠抗人CA125（北京中山生物技術有限公司）；一抗鼠抗人CgA、CK、Syn和SP免疫組織化學試劑盒（福建邁新生物技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞系培養 HO8910細胞用含10%小牛血清的DMEM培養基，在37℃，5% CO2細胞培養箱內培養。細胞培養箱內培養至對數生長期，細胞貼壁達80%以上時，用0.25%胰酶消化，制備細胞懸液，以臺盼藍測定細胞活力在95%以上，調整細胞濃度為2×107個/mL用于建模。

1.3.2 實驗動物分組 將裸小鼠共13只隨機分為兩組，即皮下種植瘤組（n=3）和原位移植瘤組（n=10）。

1.3.3 皮下移植瘤的建立 在超凈臺內，將皮下種植瘤組裸鼠75%乙醇消毒其肩胛區皮膚，皮下注射0.2 mL（2×107個/mL）的HO8910細胞懸液，建模后21 d每組隨機處死1只裸鼠，余下的觀察生存期。頻死處死的動物組織部分放入40%的甲醛液中固定；部分外科光學顯微鏡下（×14）觀察；剩余組織放液氮罐中凍存。

1.3.4 原位移植模型的建立 取皮下種植瘤活力好的組織，切成1 cm3的小塊待用。同步麻醉待移植鼠，常規消毒皮膚，從腹部切一個0.5 cm的切口，逐層分離組織，取出右側卵巢，在外科光學顯微鏡下，用顯微外科剪刀在卵巢門附近的包膜上分離一小口，將瘤組織接種于卵巢包膜內，用7-00可吸收線縫合，包埋嚴密。術后予青霉素預防感染3 d。6周處死1只，鼠間傳代（3只/代）；術后精心飼養定期觀察。

1.4 模型檢測

待動物呈頻臨死亡狀態時，脫頸處死系統解剖。

1.4.1 大體病理學觀察 動物生長狀況觀察；游標卡尺測量腫瘤大小，外科光學顯微鏡下觀察移植瘤的生長、浸潤和轉移情況，取可疑病灶經40%甲醛液固定，石蠟包埋，HE染色。

1.4.2 透射電鏡觀察 分別取皮下種植瘤、卵巢原位移植瘤、肝轉移瘤組織，戊二醛-鋨酸雙重固定，Epon-812包埋，制片染色，在JEM-EX2000透射電鏡下觀察。

1.4.3 染色體分析 機械法制備兩組移植瘤細胞懸液，傳代3次，終止培養前2～4 h，0.01%秋水仙素溶液處理，搖勻后繼續培養2～4 h，收獲細胞，carnoy溶液固定，1∶10 Giemsa染液染色，10×100倍油境觀察。

2 結果

2.1 裸鼠荷瘤情況

裸鼠皮下（3/3）及卵巢原位成瘤率為100%（10/10），卵巢原位移植肝轉移率為50%（5/10）。卵巢包膜間傳代，第2～4代出現對側卵巢和腹腔轉移，其中1只出現肝臟轉移，最早轉移出現時間2周。見圖1。

2.2 大體觀察

2.2.1 皮下種植瘤組 接種后1周內，裸鼠活躍如初，體質量不減，在種植側可觸及瘤結節，如米粒或綠豆大小；2周后皮下脂肪從背部中央開始慢慢消耗，出現短暫的無瘤期，約5～7 d，之后種植部稍膨隆，腫瘤迅速長大，荷瘤鼠行動漸遲緩，精神差。尸檢結果腫瘤組織直徑0.8～3.0 cm；自然生存時間17～40 d，平均（28.000±1.095）d。

2.2.2 卵巢原位移植瘤組 接種2周后，荷瘤鼠腹部漸膨大，精神萎靡，呈現惡病質狀態。自然生存時間19～59 d，平均（40.000±0.894）d，與皮下移植瘤組有明顯的差異（P<0.05）。解剖顯示10只裸鼠中7只肝臟呈土黃色，表面暗紅色，有散在出血點。卵巢包膜內種植傳代到第2代時有2只裸鼠出現對側卵巢增大，質地變硬，其中1只肝臟表面暗紅，有散在的米粒大灰白色結節，第3代時有2只肝表面出現散在的米粒大小灰白色結節，且布滿肝臟各分葉。肉眼剖視偶可見肺內大面積出血灶，但未見癌細胞，淋巴結也未見異常。所有種植側卵巢腫瘤都呈灰白色，圓形，有時呈現分葉狀，表面光滑，與周圍組織界限較清楚，3只荷瘤鼠有少量漿液血性腹水形成，其余部位未見明顯異常。

2.3 裸鼠卵巢HE染色結果

2.3.1 皮下種植瘤組 光鏡下觀裸鼠卵巢呈扁橢圓形，表面被覆單層立方上皮，其實質分為皮質和髓質，無明顯界限，皮質內含不同發育階段的卵泡，卵巢組織未見癌細胞浸潤。

2.3.2 原位移植及自發轉移瘤組 卵巢皮質中有癌細胞浸潤，各代移植瘤具有相似的形態學特征：癌細胞呈團、片狀排列，偶爾可見乳頭狀或腺管樣結構形成。細胞多呈大多角形、圓形，核大深染，核質比增大，間質很少，核分裂象多見，有明顯的異型性（圖2）。肝轉移灶：肝細胞索消失，肝小葉結構模糊，在排列紊亂的肝細胞之間可見小的癌巢或不規則腺腔樣結構，細胞形態似卵巢腺癌細胞，與HO8910細胞相似。

2.4 免疫組織化學結果

抗CA125、CK染色后，兩組荷瘤鼠腫瘤組織切片周邊多數細胞呈棕黃色陽性染色，陽性表達部位定位在胞漿。細胞圓形或卵圓形，較大，核大，核質比例增大，可見核分裂像。

2.5 透射電鏡觀察結果

電鏡下癌細胞核質比例增高，胞質內富含核糖體，中等量的線粒體，粗面內質網擴張，高爾基復合體發達，細胞核大，常染色質豐富，核膜增厚，染色質邊集，核仁不規則，伴細橋和分葉形成，基膜常斷續不全。細胞間橋粒少見，纖毛減少，有時在癌細胞內還可見到胞質內腔隙（圖3）。肝自發轉移瘤亦可見核質比增大，胞核見明顯的核分裂像，符合惡性腫瘤的特點。

2.6 染色體核型分析

檢查P3代終止培養的200個中期分裂相的細胞，染色體數目分布在54～68之間（超二倍體），為人型、多次傳代后的移植瘤仍保持人類腫瘤染色體的特點，均為中端和近端著絲粒染色體，無端著絲粒染色體。

3 討論

卵巢腺癌是最多見的卵巢惡性腫瘤，致癌過程仍然不甚清楚，確診時常已是晚期，可能與卵巢深居盆腔，早期臨床表現不典型有關[3]。建立理想的動物模型成為研究者關切之事。根據動物種屬不同、移植物不同、接種部位不同和研究目的不同，已建立的模型有數十種之多[4-6]。盡管如此，選擇簡便、高仿真度的模型為人們所首選。

本組選用5～7周齡裸小鼠，為性成熟期，模擬卵巢內環境，采用高轉移性卵巢腺癌細胞株建立模型，瘤細胞亞群轉移潛能高，細胞穩定，成瘤率高，本實驗皮下種植組及卵巢原位移植組成瘤率均為100%，與國內外報道一致[7-8]。在生長特性方面，皮下種植潛伏期短（1周成瘤），便于觀察，操作簡單，但不易轉移，與人體腫瘤不一致。卵巢原位移植通過鼠間組織塊種植，較好模擬卵巢局部環境，但存在觀察周期長，費用高的缺點。兩組荷瘤鼠生存期有明顯的差異，原位移植模型組中位生存期（40.000±0.894）d，長于皮下種植模型組（28.000±1.095）d，鼠間傳代轉移率下降，見對側卵巢轉移，亦可見遠處轉移到肝臟。推測可能的原因有：（1）皮下直接種植高侵襲性卵巢腺癌細胞株，瘤細胞浸潤轉移能力強；（2）腫瘤雖在皮下但靠近胸部大血管和臟器。（3）卵巢原位及轉移瘤模擬了人體情況，根據個體的內環境、免疫等狀況，轉移情況出現了差異，遠處轉移時間相對較晚。對于人體而言，腫瘤擴散主要由腹腔種植、淋巴轉移、血行轉移三種途徑。肝肺轉移，只有在晚期、復發患者才被發現。而裸鼠可通過觸摸腹部發現，這可能與裸鼠卵巢的解剖位置緊貼于腎臟表面上，而不在盆腔內有關，尚需要進一步探討。

目前國內有學者采用熒光素質粒轉染卵巢癌細胞構建整體可視化的卵巢動物模型，實時觀察卵巢癌發展、轉移規律，使得成瘤過程和發展轉歸可視[9]。為篩選更為有效的化療藥物和生物制劑，探索更為特異的早期診斷分子工具，提供了更好的平臺。但實驗條件要求較高，需借助整體熒光成像系統，推廣受到限制。

本實驗對比了同一來源、不同部位種植，誘發與自發轉移的差異，為改進卵巢腺癌動物模型提供一定的參考。至于各家實驗中的差異，還有待進一步探討。隨著實驗動物學、分子診斷技術的發展，根據實驗目的不同，選擇更好模擬人體內環境，仿真度更高并且易于操作、觀察的卵巢腺癌模型為研究者所認同。

[參考文獻]

[1] 孫瑋，傅士龍.卵巢癌動物模型研究進展[J].國際婦產科學雜志，2012，39（3）：243-246.

[2] Staffhorst RW，vander BK，Erkelens CA，et al.Antitumor activity and biodistribution of cisplatin nanocapsules in nude mice bearing human ovarian carcinoma xenografts[J]. Anticancer Drugs，2008，19（7） ：721-727.

[3] Lu C，Shahzad MM，Moreno-Smith M，et al. Targeting pericytes with a PDGF-B aptamer in human ovarian carcinoma models[J]. Cancer Biol Ther，2010，9（3） ：176-182.

[4] 侯向華，賈海軍，辛曉燕.人類卵巢癌原位移植自發轉移裸小鼠模型的構建[J].腫瘤研究與臨床，2011，23（3）：171-173.

[5] Quinn BA，Xiao F，Bickel L，et al. Development of a syngeneic mouse model of epithelial ovarian cancer[J]. J Ovarian Res，2010，11（3）：24-27.

[6] 蒲才秀，常淑芳，孫江川，等. 2種人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的生物學特性比較研究[J]. 重慶醫科大學學報，2011，36（11）：1343-1346.

[7] Nunez-Cruz S，Connolly DC，Scholler N，et al. An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses[J]. J Vis Exp，2010，4（1）：45-52.

[8] Sharrow AC，Ronnett BM.Thoburn identification and characterization of a spontaneous ovarian carcinoma in Lewis rats[J].J Ovarian Res，2010，3（2）：9-13.

[9] 黎靜，王雪飛，鐘梅.整體可視化卵巢癌原位及轉移動物模型的建立[J].廣東醫學，2012，33（4）：887-889.

（收稿日期：2012-11-21）