八角蓮洗液制備及其殺菌作用研究

[摘要] 目的 制備八角蓮洗液，并了解其殺菌效果及其毒性。 方法 提取八角蓮總黃酮和總木脂素，制成八角蓮洗液。對(duì)其采用懸液定量殺菌試驗(yàn)、毒性試驗(yàn)、真菌殺滅試驗(yàn)、陰道黏膜刺激試驗(yàn)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀(guān)察。 結(jié)果 用該產(chǎn)品對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作用2 min，殺滅率均達(dá)到100%；對(duì)白色念珠菌作用2 min，平均殺滅率為93.35%。對(duì)家兔陰道黏膜無(wú)刺激性。產(chǎn)品經(jīng)36℃放置90 d后，殺滅效果幾乎不變。 結(jié)論 八角蓮洗液有殺菌作用，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物皮膚無(wú)刺激性。

[關(guān)鍵詞] 八角蓮；鬼臼毒素；山奈酚；殺菌

[中圖分類(lèi)號(hào)] R284.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）01-46-02

八角蓮為小檗科植物八角蓮Dysosma versipellis（Hance）M. Cheng或六角蓮D. Pleiantha （Hance）Woods. 等八角蓮屬多種植物的根莖，別名鬼臼，是我國(guó)傳統(tǒng)的民間常用藥之一，具有清熱解毒、祛痰散結(jié)、祛淤消腫的功效[1]。八角蓮屬類(lèi)植物普遍含有鬼臼毒素（Podophyllotoxin）等芳香四氫萘類(lèi)木脂素，具有較強(qiáng)的抗腫瘤和抗病毒等活性。此外還有黃耆甙（Astragalin）、金絲桃甙（Hyperin）、槲皮素（ quercetin） 、山柰酚（Kaempferol）等多咱黃酮類(lèi)成分[2]。研究者從八角蓮中提取出富集了總木脂素和總黃酮的提取物，制成八角蓮洗液，用于男女外陰部滅菌消毒。為探討其殺菌效果和毒性，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了有關(guān)試驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

1.1.1 藥材來(lái)源 八角蓮藥材（安徽產(chǎn)）購(gòu)自成都荷花池中藥材專(zhuān)業(yè)市場(chǎng)，經(jīng)西華大學(xué)生命科學(xué)院楊文宇教授鑒定為Dysosma versipellis（Hance）M.Cheng的根莖。

1.1.2 殺菌試驗(yàn)[3] 材料：供試樣品：八角蓮洗液。大腸桿菌（8099）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、白色念珠菌

（ATCC10231）由中國(guó)普通微生物菌種保藏中心提供。中和劑：0.5%硫代硫酸鈉+0.5%卵磷脂+0.5%甘氨酸+0.5%吐溫80的0.03 mol/L的PBS溶液。動(dòng)物：由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專(zhuān)委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)提供的健康、初成年的雌性家兔6只，體重2.0～2.3 kg，許可證號(hào)：SCXK[川]2008-14。普通級(jí)，動(dòng)物采用單籠喂養(yǎng)。

1.2 提取工藝

八角蓮藥材，粉碎為粗粉，用8倍量95%乙醇滲漉，回收乙醇，浸膏用乙酸乙酯洗滌過(guò)濾，濾液回收溶劑，浸膏用混合有機(jī)溶劑（乙酸乙酯︰環(huán)已烷 2︰1）加熱回流洗滌，過(guò)濾，濾液回收溶劑，浸膏烘干粉碎，得八角蓮提取物A，備用。

1.3 含量測(cè)定

經(jīng)HPLC法測(cè)定，提取物A中鬼臼毒素含量為33.2%[4]，山奈酚含量為4.5%。經(jīng)紫外分光光度法測(cè)得總黃酮含量為10.8%[5]。

1.4 樣品制備

取八角蓮提取物A干粉80 g，加熱溶于1 200 mL吐溫80中，加入丙二醇4 000 mL，卡松、乙氧基化烷基硫酸鈉（AES）等輔料適量，加熱攪拌至溶液清亮。逐步加入純化水，邊加邊攪拌，加至溶液總體積為40 L，分裝，每瓶裝200 mL溶液，密封，得八角蓮洗液樣品199瓶。其中鬼臼毒素含量為0.66 mg/mL。樣品為淡黃色澄清液體，在自然光下放置6個(gè)月，外觀(guān)不發(fā)生變化。

1.5 殺菌試驗(yàn)方法

檢驗(yàn)依據(jù)：《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）2.1.1.5.5中和劑懸液定量鑒定試驗(yàn)操作程序，2.1.1.9真菌殺滅試驗(yàn)，2.1.1.7.4懸液定量殺菌試驗(yàn)操作程序，2.2.3消毒產(chǎn)品穩(wěn)定性測(cè)定（微生物法），2.3.5陰道黏膜刺激試驗(yàn)。

1.5.1 中和劑鑒定試驗(yàn) 試驗(yàn)菌為金黃色葡萄球菌和白色念珠菌。試驗(yàn)用樣濃度100%。試驗(yàn)溫度20℃，重復(fù)次數(shù)3次。

1.5.2 殺菌試驗(yàn) 白色念珠菌采用2.1.1.9真菌殺滅試驗(yàn)，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌采用2.1.1.7.4懸液定量殺菌試驗(yàn)操作程序。試驗(yàn)用樣濃度100%。試驗(yàn)溫度20℃，重復(fù)次數(shù)3次。

1.5.3 陰道刺激性試驗(yàn) 試驗(yàn)分染毒組及空白對(duì)照組，每組3只雌性家兔。操作程序參見(jiàn)《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）2.3.5.4。根據(jù)《消毒技術(shù)規(guī)范》（2002年版）中表2-16、2-17進(jìn)行陰道黏膜刺激反應(yīng)評(píng)分分級(jí)和強(qiáng)度分級(jí)。

1.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 樣品原包裝PE瓶密封，于36℃恒溫箱中放置90 d。觀(guān)察存放后對(duì)白色念珠菌殺滅效果變化。

2 結(jié)果

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)表明，用0.5%硫代硫酸鈉+0.5%卵磷脂+0.5%甘氨酸+0.5%吐溫80的0.03 mol/L的PBS溶液溶液作為中和劑，可有效中和該樣品100%濃度對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的殺滅作用，且該中和劑及中和產(chǎn)物對(duì)受試細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖和培養(yǎng)基無(wú)影響。

2.2 殺菌效果

試驗(yàn)表明，該樣品100%濃度分別對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌作用2 min，平均殺滅率分別為100%、100%和93.35%。陰性對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)。見(jiàn)表1。

2.3 陰道刺激性試驗(yàn)

試驗(yàn)組家兔陰道黏膜接觸該洗液之后，肉眼觀(guān)察未見(jiàn)充血和水腫。組織病理學(xué)檢查結(jié)果，陰道黏膜刺激反應(yīng)評(píng)分為0，屬無(wú)刺激性。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)（微生物）

結(jié)果顯示，該樣品經(jīng)36℃放置90 d后，對(duì)白色念珠菌的殺滅效果與存放前基本一致。故該產(chǎn)品貯存有效期可定為2年。見(jiàn)表2。

3 討論

八角蓮提取物中的有效成分黃酮與木脂素均為脂溶性，在水中溶解性不佳。有中藥洗液采用酒精為溶劑。但酒精易揮發(fā)，且對(duì)敏感部位皮膚有一定刺激性。經(jīng)多次試驗(yàn)，筆者采用了吐溫和丙二醇增溶的方法，二者在洗液中含量?jī)H為3%和10%，自然光下放置6個(gè)月及36℃恒溫箱中放置90 d，外觀(guān)性狀均不發(fā)生變化。

八角蓮中的黃酮與木脂素均有良好的殺菌消毒作用[6]。在制備八角蓮洗液過(guò)程中通過(guò)提取精制將這兩類(lèi)成份富集到一起，協(xié)同作用，也緩解了單用鬼臼毒素類(lèi)木脂素可能造成皮膚刺激性的問(wèn)題。同時(shí)在精制過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)混合有機(jī)溶劑（乙酸乙酯︰環(huán)已烷）的構(gòu)成比例，可控制產(chǎn)物中總黃酮比總木脂素的含量比，以期達(dá)到最優(yōu)組合。上述試驗(yàn)中可見(jiàn)八角蓮洗液對(duì)家兔陰道黏膜無(wú)刺激性，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有殺菌作用。在保證皮膚安全性的前提下，八角蓮洗液中鬼臼毒素含量達(dá)到了0.66 mg/mL，提示八角蓮洗液在起到男女外陰部殺菌消毒作用的同時(shí)可能對(duì)尖銳濕疣等毒性性病的治療有一定的積極作用。對(duì)于八角蓮洗液在治療尖銳濕疣中的具體作用，以及八角蓮中黃酮與鬼臼毒素類(lèi)木脂素之間可能的協(xié)同作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 盧軍.八角蓮的藥理及臨床應(yīng)用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2009，25（23）：3608-3609.

[2] 呂敏，蘇艷芳，郭增軍，等.八角蓮屬植物化學(xué)成分及生物活性研究概況[J].西北藥學(xué)雜志，2007，22（3）：152-153.

[3] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.消毒技術(shù)規(guī)范（2002年版）[S].2002.

[4] 俞培忠，姚莉韻，王麗平.HPLC法測(cè)定4種八角蓮中鬼臼毒素的含量[J].上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，25（6）：452-453.

[5] 徐國(guó)兵，黃萬(wàn)著，王德群，等.百蕊草藥材中山奈酚和總黃酮的含量測(cè)定[J].中醫(yī)藥學(xué)，2008，136（11）：39-42.

[6] 趙立春，何穎，岳桂華，等.八角蓮屬藥用植物化學(xué)成分及生理活性研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2009，18（13）：37-39.

（收稿日期：2012-09-27）