生物質譜技術在中藥研究中的應用

[摘要] 生物質譜技術為中藥研究尤其是大分子藥物的研究提供大量的結構信息，因而近幾年發展比較快速。本資料從生物質譜技術在中藥藥學研究、中藥作用相關蛋白研究、中藥與生物大分子的相互作用研究、中藥治療的蛋白質組學研究以及代謝組學研究等幾個方面綜述了近幾年生物質譜技術在中藥研究中的進展，以供同行參考。

[關鍵詞] 生物質譜；中藥；電噴霧質譜；基質輔助激光解吸電離質譜；飛行時間質譜

[中圖分類號] R284 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）01-81-02

質譜技術能夠通過測定離子化后分子的質荷比得到相關分子的質量。近年來，質譜技術已經廣泛用于各學科研究中。20世紀80年代，電噴霧電離（ESI）和軟激光解吸（SLD）電離技術的發展則使得質譜技術應用于高分子量分子的研究中。這些新的質譜技術在生命科學中的應用，逐步形成了獨具特色的生物質譜技術（biological mass spectrometry）。生物質譜技術是將質譜技術用于精確測量生物大分子，如蛋白質、核苷酸和糖類等的分子量，并提供分子結構信息的新技術[1]。近年來，生物質譜已經廣泛用于中藥研究領域，推動了中藥現代化及中藥作用機制等更深層次的研究，本資料綜述了近幾年生物質譜技術在中藥研究中的進展，現報道如下。

1 中藥的藥學研究

質譜技術應用于中藥單體化合物的結構鑒定與解析的基本思路和做法與用于小分子化學藥物相同，此方面已有大量的文獻報道[2]。本資料重點介紹生物質譜用于動物藥材中大分子蛋白和多肽測定。王若光等[3-6]采用飽和硫酸胺沉淀，透析脫鹽凍干法獲得中藥阿膠、地龍、龜甲膠、羚羊角的蛋白/肽，利用蛋白質芯片為載體，激光解析-離子化-飛行時間質譜技術（SELDI-TOF-MS）技術，分析阿膠、地龍、龜甲膠的蛋白質、肽分子量分布及其相對分子質量，發現不同質量濃度穩定獲得的有意義蛋白、肽。如將蛋白進一步分析鑒定，可以形成中藥材蛋白質，肽成分質量指紋圖，可為數字化質控標準提供依據。但是，由于中藥材地域來源不同，大分子物質的指紋圖譜也不盡相同，此項工作未對不同來源的中藥材進一步考察，故還需要進一步完善。

2 中藥作用相關蛋白研究

研究中藥的作用機制必須清楚中藥作用后的物質變化，生物質譜可以用來對中藥作用后的相關蛋白等大分子物質進行分析。劉鵬等[7]采用腹腔注射內毒素（LPS）復制內毒素肝損傷模型， 清熱解毒涼血化瘀中藥干預，用SELDI-TOF-MS技術分析大鼠血清差異表達蛋白，共獲得與芯片結合的11個有效蛋白質峰，各組大鼠的血清內存在的差異表達蛋白，有助于內毒素肝損傷的進一步研究。此項工作需更進一步對產生差異的蛋白進行鑒定，才可揭示此類蛋白在中藥干預機制中的意義或作用。

3 中藥與生物大分子的相互作用

研究中藥化學成分與生物大分子的相互作用可以找到中藥與靶分子的作用機制，進一步闡明中藥的作用機制。生物質譜的軟電離技術可以測得中藥小分子與蛋白等大分子相互作用的化學計量比，計算二者之間的結合強度、確定藥物的結合位點以及獲得反應動力學等多方面的信息。主要有兩種思路：（1）通過測定復合物的相對豐度比較中藥小分子與蛋白等大分子的相對作用強度；（2）通過比較中藥小分子藥物濃度加入蛋白等大分子前后的變化來推斷兩者的相對作用強度，目前，已應用生物質譜測定中藥小分子與核酸如DNA、蛋白或多肽等大分子之間相互作用的研究[8]。例如，Zhang H等[9]利用ESI-MS研究了人參皂苷與細胞色素C之間的相互作用，獲得K（D）值。鄭州大學陳曉嵐等[10-11]對一些磷酰化修飾的黃酮類中藥與溶菌酶和α-乳白蛋白之間的相互作用進行了研究，計算出結合常數，推算出兩者的結合力類型。盡管生物質譜為中藥小分子與生物大分子之間的相互作用提供了很好的研究手段，但應該看到，由于中藥的復雜性以及研究環境與體內有很大的差異，許多研究結果還需要體內實驗的驗證。

4 中藥治療的蛋白質組學研究

蛋白質組學是近年醫藥和生命科學領域研究的熱點之一。蛋白質組學的含義是：一個基因組、一種生物或一種細胞/組織所表達的全套蛋白。蛋白質組學的核心在于大規模地對蛋白質進行綜合分析，通過對某種物種、個體、器官、組織或細胞的全部蛋白質性質（包括表達水平、結構、翻譯后修飾、細胞內定位、蛋白質相互作用等）的研究，對蛋白質所執行的生理性、病理性生命活動做出最精細、最準確、最本質的闡述[12]。

中藥治療的蛋白質組學研究的基本研究思路是，首先造模，確定造模成功后提取總蛋白質，2-DE電泳技術分離總蛋白建立蛋白質組圖譜，用圖像分析軟件尋找模型組、對照組及中藥治療組各組間差異蛋白點，MALDI-TOF/MS分析差異蛋白點，并結合蛋白質生物信息庫，初步鑒定差異蛋白質。在此方面國內學者進行了一些探索[13-14]，有學者研究了單體人參皂苷對人肺巨細胞癌高轉移細胞株蛋白質組的表達的影響，還有報道研究松果菊苷對小鼠帕金森病模型黑質紋狀體組織蛋白表達的影響， 再如研究中藥復方強骨寶1號對去卵巢骨質疏松大鼠皮質骨蛋白質組表達的影響等。以上研究結果找到一些差異蛋白，為中藥作用機制的研究提供了依據。

5 代謝組學研究

生物質譜用于中藥代謝組學研究是通過比較不同劑量中藥小分子對機體干預后代謝譜的異同，找到生物標志物（ biomarker） 或生物標志模式（ biomarker patterns），為中藥對不同證候的作用提供系統的支持。戴偉東等[15]用代謝組學方法評價了中藥通心絡和人參對過度疲勞大鼠的干預作用。通過構造大鼠過度疲勞模型，并分別用通心絡和人參進行干預，采用快速液相色譜-離子阱-飛行時間質譜（UPLC-IT-TOF-MS） 獲取大鼠血漿代謝輪廓，并用正交偏最小二乘法（OPLS）進行多變量統計分析，分別找出用于區分通心絡和人參干預組大鼠同正常對照大鼠、過度疲勞大鼠的重要差異代謝物。結果顯示過度疲勞大鼠體內的色氨酸、膽汁酸、溶血磷脂酰膽堿等代謝通路發生較大變化，經通心絡或人參干預的大鼠整體代謝輪廓趨向正常水平，并能夠部分調節上述發生變化的代謝通路使之往正常方向變化。

綜上所述，生物質譜在中藥研究中的廣泛應用為中藥的藥學研究及中藥作用機制的研究提供了更為深入的研究手段。但是，需要注意的是用生物質譜對于中藥結合大分子的鑒定還需要用標準蛋白對比，否則需要用其他輔助手段鑒定；另外，在方法學建立方面，還需要慎重考慮，除了考慮陰性與陽性對照以外，還需要考慮方法的專屬性、精密度和重復性，避免假陽性和假陰性結果的出現。

[參考文獻]

[1] 鄒麗敏，李博，劉文英.生物質譜技術的發展及在蛋白質結構研究中的應用[J].藥學進展，2008，32（8）：49-55.

[2] 董巍，孫文軍，王喜軍.中藥生物堿類成分的質譜裂解規律研究進展[J].世界中西醫結合雜志，2011，6（9）：812-815.

[3] 王若光，尤昭玲，劉小麗.基于激光解析/離子化-飛行時間質譜技術的中藥阿膠蛋白質組分析[J].中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（13）：2518-2521.

[4] 王若光，李春梅，王陸穎.以蛋白質芯片為中藥蛋白質/肽相互作用載體分析中藥地龍生干品和炮制品的生物學特征[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（13）：2489-2492.

[5] 李春梅，王若光，王陸穎.基于激光解析/離子化飛行時間質譜技術的中藥龜甲膠蛋白質組分析[J].湖南中醫藥大學學報，2007，27（6）： 21-24.

[6] 張燁，王若光，王陸穎.以蛋白質芯片為中藥蛋白質/肽相互作用載體分析羚羊角的生物學特征[J].湖南中醫藥大學學報，2009，29（6）： 15-18.

[7] 劉鵬，文海花，王開正.應用SELDI-TOF-MS技術分析清熱解毒涼血化瘀對內毒素肝損傷大鼠蛋白質表達的影響[J].時珍國醫國藥，2011， 22（7）：1686-1687.

[8] 王兆伏，宋鳳瑞，劉志強.質譜技術在中藥小分子與生物大分子相互作用研究中的應用[J].質譜學報，2010，31（3）：129-137.

[9] Zhang H， Ding L， Qu C， et al. Study on the noncovalent complexes of ginsenoside and cytochrome c by electrospray ionization mass spectrometry[J].Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2007 ，68（2）：312-316.

[10] 陳曉嵐，于斐，屈凌波，等. 熒光及ESI質譜法研究溶菌酶與磷酰化黃酮的相互作用[J]. 化學學報，2004，62（2）：188-193.

[11] 吳建麗，陳曉嵐，屈凌波，等.α-乳白蛋白與磷酰化黃酮弱相互作用ESI質譜研究[J].分析測試學報，2006， 25（3）：22-26.

[12] Blackstock W， Mann M.Aboundless future for proteomics[J].Trends Biotechnol， 2001， 19（suppl）： s1-s2.

[13] 鐘衛干.蛋白質組學技術在中藥作用機理研究中的應用[J].中醫藥導報，2009，15（9）：74-77.

[14] 蘇友新，李遠志，鄭良樸.強骨寶1號對去卵巢骨質疏松大鼠皮質骨蛋白質組的影響[J].福建中醫藥，2011，42（1）：1-3.

[15] 戴偉東，張鳳霞，賈振華.基于液相色譜-質譜聯用技術的代謝組學方法用于中藥通心絡和人參對過度疲勞大鼠干預作用的評價[J].色譜，2011，29（11）：1049-1054.

（收稿日期：2012-10-22）