DNA甲基化與結直腸癌的預后及治療進展

[摘要] DNA甲基化是結直腸癌常見的表觀遺傳性改變，甲基化的異常可引起腫瘤癌基因的激活以及抑癌基因的失活，因此在結直腸癌的發生發展中有重要的意義。DNA甲基化的改變可導致結直腸癌出現不同的預后。且因為甲基化過程是可逆的，故其有望成為結直腸癌治療新靶點。現就DNA甲基化在結直腸癌的預后及治療方面做一簡要綜述

[關鍵詞] DNA甲基化；結直腸癌；預后；治療

[中圖分類號] R735.3+7 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）01-48-04

1939年Waddington[1]提出了表觀遺傳學概念，其后Holliday[2]對其進一步完善，其主要內容為不涉及DNA序列變化的基因表達遺傳改變，該改變具有可遺傳性及可逆性包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質重塑及基因組印跡等內容。其中又以DNA甲基化與腫瘤的關系研究較為深入，其在腫瘤預防、診斷、治療、預后判斷等多方面均發揮著重要作用。結直腸的發生發展涉及到多個不同癌基因及抑癌基因異常，甲基化通過不同機制可影響相應基因的表達，從而對腫瘤細胞周期、DNA修復、細胞代謝、信號傳導等產生不同作用，在結直腸癌的發生發展中有重要的意義。一系列的研究證實結直腸癌的預后及治療與腫瘤中基因甲基化有著密切關系，同樣病理類型的腫瘤因甲基化的不同有著不同的預后。去甲基化治療亦有望為結直腸癌治療提供另一種新思路。

1 DNA甲基化

基因組堿基胞嘧啶（C）5'-碳原子在DNA轉移酶（DNA methytransfere，DNMT）作用下以S-腺苷甲硫酸（SAM）提供甲基（-CH2）生成5'-甲基胞嘧啶（5'-mC）的化學修飾過程稱為DNA甲基化。在真核生物體內異常甲基化大多發生在CpG島[3]。CpG島為基因組中一段長約300～3 000 bp的富含CpG二核苷酸的區域，主要存在基因的5'啟動子及第一外顯子區域。CpG序列在人類基因組中出現的頻率約為10%，可分為兩大類，其中70%～80%為甲基化稱為甲

基化的CpG序列，20%～30%為非甲基化狀態，非甲基化的CpG富集即稱為CpG島。在人類基因組中約有4萬個CpG島，健康個體CpG島內CpG序列為非甲基化狀態，島外的CpG序列多為甲基化狀態[4]。異常個體可見CpG島內CpG序列發生甲基化。CpG島甲基化不同狀態可調控基因表達，參與生物發育及腫瘤發生。

目前發現的DNA甲基化轉移酶主要有四種[5]即DnmT1、DnmT2、DnmT3a、DnmT3b。根據其結構和功能的不同可分為兩大類：即維持甲基化狀態的酶DnmT1；從頭甲基化酶及甲基化延伸有關酶DnmT3a、DnmT3b；而DnaT2的作用尚不確切，目前認為其DNA甲基化轉移酶的作用弱，主要作用為使RNA分子甲基化，即可使tRNAASP反密碼子環38胞嘧啶甲基化，從而影響氨基酸合成。DNA甲基化轉移酶的抑制可起到逆轉甲基化的作用從而恢復基因的正常表達，可作為臨床治療腫瘤的一個“靶點”。

2 甲基化與結直腸癌

甲基化在腫瘤中的表現主要為廣泛的低甲基化以及局部高甲基化[6-8]，近來一項應用基因組微陣例研究技術發現，隨著腫瘤的發展在基因組非編碼區低甲基化程度越來越高，而CpG島高甲基化程度也逐漸加重[9-10]。甲基化可能通過下述途徑引起腫瘤的發生：（1）抑癌基因啟動子的CpG島甲基化可致相應基因表達沉默；（2）廣泛的低甲基化可致癌基因激活；（3）甲基化的堿基可增加基因的突變頻率；其中抑癌基因的沉默在腫瘤的發生中作用較為突出，結直腸癌可涉及多種異常甲基化基因[11]，如 CDKN2A（P16）、SFRP2、CDH13、hMLH1、MGMT等。翟榮林等[12]檢索了1979～2008年得Medline及CNKI數據庫發現多種基因甲基化與結直腸癌相關，如c-myc基因低甲基化可能與腫瘤早期事件有關，hMLH1基因與右側散發性結腸癌及其分期有關，而ERβ基因可能與預后有關。這些基因沉默涉及細胞周期、信號通路、轉移粘附的異常從而影響腫瘤發生發展。

3 DNA甲基化與結直腸癌的預后判斷

3.1 錯配修復基因缺失與結直腸癌

結直腸癌遺傳物質的不穩定涉及染色體的不穩定和微衛星不穩定。在人類基因組中存在著由同一脫氧寡核苷酸重復串聯而成的序列，其重復順序為1-6bp，長約350 bp的片段即稱為微衛星，微衛星在人體中表現出高度的個體特異性，并且穩定遺傳。微衛星不穩定（micoseatallite insability，MSI）即是由復制差錯引起的簡單重復序列的改變，即不同個體同一微衛星位點的不同或者是同一個體正常組織與異常組織的微衛星位點的差異。MSI根據基因錯配修復的頻率可分為低頻微衛星不穩定（MSI-L），高頻微衛星不穩定（MSI-H），MSI-H亦可稱為復制錯誤（replication error，RER）有實驗證實錯配修復基因啟動子甲基化異常可導致錯配修復基因的微衛星不穩定[13]。結直腸癌中存在著錯配修復基因的異常微衛星不穩定，常見錯配修復基因有hMSH2、hMSH6、hMSF1、hPMS1、hPMS2、hMLH1等幾種。其中hMLH1、hMHL2兩個基因幾乎與100%家族性遺傳學息肉性疾病（hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC）及15%散發性結直腸癌有關[14-15]，家族性遺傳性息肉性疾病大多與hMLH1、MSH2、MSH6及PMS2有關。而散發性結直腸癌大多與hMLH1基因啟動子甲基化有關。同時目前研究發現散發性結直腸癌還多伴有BRAF V600E 基因突變，而在家族遺傳性息肉疾病中少有BRAFV600E的突變。而臨床上檢測BRAF基因是應用表皮生長因子受體單克隆抗體的重要步驟，BRAF基因突變對治療易耐藥[16]。散發性MSI的結直腸癌中有約50% hmslh1及hmslh2的基因存在甲基化，甲基化及微衛星不穩定均可導致錯配修復基因特別是hMHL1及hMHL2表達缺失[17]。目前認為MSI-H散發性結直腸癌大多具有相同的臨床性質：發病年齡輕；多位于近端結腸，且容易伴有腸外腫瘤；對某些化療藥物耐藥；低分化腺癌、黏液腺癌、印戒細胞癌多見；但較少發生淋巴轉移并且生物學行為好[18]。基于Sargent等[19]的工作，2012版結直腸癌NCCN指南要求對小于50歲的患者均應考慮行MMR的檢測，錯配修復缺失（dMMR）是Ⅱ期結腸癌預后好的指標，單純術后5年生存率約為80%，且該特征患者不但不能從5-Fu化療中獲益，反而可能有害。同時指南還推薦對所有Ⅱ期結直腸癌準備接受5-Fu治療的均需要dMMR檢測。病理也同樣發現特征性大MSI-H樣病理結直腸癌：（1）腫瘤淋巴細胞浸潤（每高倍鏡大于3個淋巴細胞）；（2）癌周crohn樣細胞浸潤邊緣淋巴組織或者濾泡形成；（3）黏液腺癌及印戒細胞癌分化；（4）髓樣生長；（5）右側結腸多見；（6）預后相對較好。其原因尚不清楚，最初實驗發現某一突變頻率很高的細胞可耐受足以殺死自身的烷化劑，后來發現正因為該細胞有錯配修復基因缺失。在正常情況下即有錯配修復系統存在時如果錯配的堿基在烷化劑作用下沒有與相應的堿基配對，則會因錯配修復時產生空缺而至細胞DNA斷裂死亡。而在錯配修復系統缺失即MSI-H腫瘤細胞中，同樣因烷化劑致堿基配對錯誤時因其沒有修復錯誤堿基而至異常堿基得以存在細胞因此可存活。這也似乎從分子層面解釋了在Ⅱ其結直腸癌中若存在dMMR者應用5-Fu效果不佳的原因。

3.2 甲基子表型與結直腸癌

1999年Toytota[20]在檢測了多個腫瘤抑癌基因后提出了甲基子表型（CpG island methylator phenotype， CIMP）概念。甲基子表型是反映多個抑癌基因同時過甲基化的現象。但應該有多少基因同時甲基化才稱甲基子表型陽性，目前文獻中沒有特殊定義，一般以同時檢測的抑癌基因的2/3、3/5、2/5不等，為此有學者建議根據所檢測甲基化位點的數目將CIMP分為CIMP-Low及CIMP-High[21]。結直腸癌中多個基因甲基化現象較突出，Xiao等[22]檢測了65例結直腸癌患者17個基因的甲基化狀況，其中有93.8%（61/65）的病例有5個以上基因過甲基化，86%（56/65）有6個以上基因過甲基化。這進一步說明甲基子表型在結直腸癌中的存在。Koichi Yagi等[23]檢測了149例結直腸癌不同基因甲基化，將其分為高甲基化表型、中甲基化表型及低甲基化表型，同時檢測了KRAS及BRAF基因的變異。發現高甲基化表型與BRAF變異及高度微衛星不穩定有關，中度甲基化表型合并KRAS基因變異是結直腸癌不良預后的指正，Jass[24]結合甲基子表型和微衛星不穩定將結直腸癌分為5種類型，第1型：高甲基子表型、高度微衛星不穩定、BRAF變異。約占12%，主要起源鋸齒狀息肉。第2型：高甲基子表型、低度微衛星不穩定或者微衛星穩定、BRAF變異，約占8%，可起源鋸齒狀息肉。第3型：低甲基子表型、微衛星穩定或者低度微衛星不穩定、KRAS基因變異，約占20%，可起源腺瘤及鋸齒狀息肉。第4型：甲基子表型陰性、微衛星穩定。約占57%，主要起源腺瘤。第5型：甲基子表型陰性、高度微衛星不穩定也即Lynch 綜合征，占3%，主要起源腺瘤。并且上述不同類型結直腸癌在患者性別、分化程度、淋巴結情況等方面均有不同。甲基子表型陽性者其腫瘤多發右半結腸、常有淋巴結轉移，分化期較晚等表現[25-26]。并且有人提出甲基子表型陽性是結直腸癌5-Fu治療療效預后的判斷指標。結直腸癌的發生發展涉及多個不同的分子生化途徑異常，但甲基化與微衛星不穩定兩條途徑在其中的作用較為突出。從上可以看出結合CIMP與MSI二者在腫瘤中的表現可將腫瘤分出不同亞型，而不同類型腫瘤在細胞分化、對藥物反應、預后方面均有差異。提示二者可能存在相同分子、遺傳機制。深入研究其關聯可為臨床提供有力應用工具

4 甲基化與結直腸癌的治療

甲基化的過程是可逆的，這就為甲基化在腫瘤的治療提供了思路。目前應用甲基化原理治療腫瘤關鍵靶點集中在DNA甲基轉移酶上，主要通過抑制甲基化轉移酶的從而取到逆轉基因甲基化的目的以恢復正常表達。然而甲基化治療藥物也有不少限制，如作用靶點分散，治療的同時可影響正常基因甲基化狀態。目前有多種藥物進行了臨床實驗，有涉及實體瘤、血液疾病的。根據其化學結構的不同甲基化抑制藥物可分為核苷類及非核苷類兩種。核苷類藥物在體內可代謝為三磷酸脫氧核苷，在基因復制時替代DNA序列上胞嘧啶堿基與DNA甲基轉移酶結合，從而阻斷甲基化過程。該類藥物主要包括5-氮雜-2'-脫氧胞苷酸（5-aza-2'-deoxyoytidine，地西他賓）、阿扎胞苷、折布拉林等。非核苷類又包括兩類藥，一是在研究中發現其有去甲基化作用但機制尚不清楚，如普魯卡因、普魯卡因氨、肼屈嗪、表沒食子兒茶素沒食子酯酸（epiga llocatechin-3-O-gallate，EGCG）等。另一類即反義寡核苷酸類藥，有代表性的是MG98。但研究最多的還是集中在5-脫氧雜氮胞苷[27]，其衍生物5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2-deoxyoytidine，地西他賓）于2006年經美國FDA批注用于多發性骨髓瘤及部分白血病的治療。5-氮雜-2'-脫氧胞苷酸主要通過磷酸化后直接摻如DNA抑制Dnat1、Dnat3a、Dnat3b三種甲基轉移酶，引起低甲基化過程，恢復基因表達、促進細胞分化及凋亡。Laird 等[28]以APC基因異常腸道多發腺瘤小鼠為模型給以5-氮雜-2'-脫氧胞苷酸治療80 d，其腸道腺瘤數由平均130降至20個[29]。然而5-氮雜-2'-脫氧胞苷酸的作用不止逆轉甲基化方面，Matthias Schaefer等[30]研究證實其在逆轉甲基化的同時還有化療藥物增敏作用，5-氮雜-2'-脫氧胞苷酸可同過作用結直腸癌細胞以降低多耐藥基因（MDR）甲基化水平，從而提高其對化療藥物奧沙利鉑的作用。然而目前地西他賓在實體瘤的治療中尚未取得明顯進展。上述研究證實5-脫氧雜氮胞苷除有和地西他濱一樣的抑制作用外，其還可以抑制DNMT2底物tRNAASP 38胞嘧啶甲基化的功能，而地西他濱無該功能。tRNA與多種蛋白及RNA的轉錄表達有關，去甲基化同樣可影響體內相關蛋白表達，這也為非核苷類藥物在腫瘤中的治療提供又一思路。

反義寡核苷酸類藥物（antisense oligonucleotides），反義寡核苷酸即一段人工合成的可與靶基因或mRNA某一段互補的核苷片段，其可以通過堿基互補原則與靶基因及mRNA結合從而封閉基因表達。MG98是一種常用于甲基化治療的藥物，屬于反義寡核苷酸的一種，實驗證實該藥可以選擇性封閉DNMT1的表達，而不影響其他甲基轉移酶。MG98還可以使甲基化沉默的基因重新表達，并且在其濃度達到25～27 nmol/L時可抑制腫瘤細胞的增殖，在體內也同樣觀察到MG98實實體瘤的體積減小。Davis等[31]最早開展了MG98在實體瘤中的臨床Ⅰ期試驗，試驗公納入14例患者均為復發實體瘤，其中結直腸癌7例，非小細胞肺癌3例，宮頸癌2例，食管癌1例，卵巢癌1例。共4周療程后其中疾病穩定SD 3例，疾病進展PD 9例。Ⅱ期臨床試驗主要針對轉移腎癌，由Winguist等[32]實施，共納入19例轉移性腎癌，同樣4周療程后SD 6例，PD 9例。除此外MG98也被用于與干擾素-α聯合應用不能手術切除的轉移性腎癌的治療[33]。在總共9例的病例中經治療后3例取得了疾病穩定（SD）例取得例部分緩解（PR）。總之MG98目前在實體瘤中治療取得一定的治療作用，然而大多數治療還集中在轉移性腎癌上，隨著研究的升入有望成為結直腸癌的一種新治療手段。

5 討論

DNA甲基化參與了腫瘤的發生、發展全過程，在腫瘤的預防，診斷、預后判斷、治療中發揮著重要的作用。目前臨床上結直腸癌的預后判斷多基于NCCN指南及腫瘤的TNM分期，但部分腫瘤并非完全與此相符。對美國國立癌癥研究所流行病學和遠期檢測結果計劃（surveillance，epidemiology and end results，SEER）數據庫1991～2000年共119 393例結腸癌分析可以了解結腸癌各期的5年生存率：84.7%（ⅡA期），72.2%（ⅡB期），83.4%（ⅢA期）64.1%（ⅢB期），44.3%（ⅢC期）和8.1%（Ⅳ期）[34]。可發現部分依據TNM分期者與預后缺失相關性，如部分ⅢA期生存率反而高于ⅡB期。同樣傳統觀念中結直腸癌黏液腺癌、印戒細胞癌惡性程度較高，然而因其基因甲基化的不同部分低分化腫瘤有好的預后，目前尚無工具用于臨床結直腸癌預后判斷，隨著甲基化研究的深入可望對上述現象做合理解釋，并用于臨床預后判斷。

結直腸癌的治療目前多集中于手術為主輔以放療、化療的綜合治療。甲基化在腫瘤中的治療除在血液疾病其得臨床應用而外，其他實體瘤的治療大多處于實驗階段。目前尚無專門設計針對結直腸癌的臨床實驗開展。甲基化轉移酶抑制劑應用于臨床因其涉及全基因組甲基化故而作用靶點分散，這也給治療帶來了較大副作用大。隨著藥物設計不斷改進其有望成為結直腸癌治療的一個新途徑。

[參考文獻]

[1] Waddington CH.Preliminary notes on the development of the wings in normal and mutant strains of drosophila[J].Proc Natl Acad Sci USA，1939，25：299-307.

[2] Holliday R.The inheritance of epigenetic defects[J].Science，1987，238：163-170.

[3] Manel Esteller，M.D Ph.D.Molecular origins of cancer[J].Epigenetics in Cancer N Engl J Med，2008，358：1148-1159.

[4] Weber M，Hellmann I，Stadler MB，et al.Distribution，silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome[J].Nat Genet，2007，39：457-460.

[5] Brueckner B，Lyko F.DNA methyltransferase inhibitors：old and new drugs for an epigenetic cancer therapy[J].TrendsPharmacol Sci，2004，25：551-554.

[6] Feinberg AP，Vogelstein B.Hypomethylationdistinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts[J].Nature，1983，301：89-92.

[7] Sakai T，Toguchida J，Ohtani N，et al.Allelespecific hypermethylation of the retinoblastomatumor-suppressor gene[J].Am J Hum Genet，1991，48：880-888.

[8] Gonzalez-Zulueta M，Bender CM，Yang AS，et al.Methylation of the 5'CpG island of the p16/CDKN2 tumor suppressor gene in normal and transformed human issues correlates with gene silencing[J].Cancer Res，1995，55：4531-4535.

[9] Weber M，Davies JJ，Wittig D，et al.Chromosome-wide and promoter-specificanalyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells[J].Nat Genet，2005，37：853-862.

[10] Fraga MF，Herranz M，Espada J，et al.A mouse skin multistage carcinogenesismodel reflects the aberrant DNA methylation patterns of human tumors[J].Cancer Res，2004，64：5527-5534.

[11] Esteller M.Cancer epigenomics：DNA methylomes and histone-modification maps[J].Nat Rev Genet，2007，8：286-298.

[12] 翟榮林，王國斌，蔡開琳.結直腸癌相關基因甲基化研究現狀及進展[J].中華腫瘤防治雜志，2008，15（7）：556-558.

[13] Kane MF，Loda M，Gaida GM，et al.Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines[J].Cancer Res，1997，57：808-811.

[14] Grady WM.Genomic instability and colon cancer[J].Cancer Metastasis Rev，2004，23：11e27.

[15] Kane MF，Loda M，Gaida GM，et al.Methylation of the hMLH1 promoter correlates with lack of expression of hMLH1 in sporadic colon tumors and mismatch repair-defective human tumor cell lines[J].Cancer Res，1997，57：808e11.

[16] Domingo E，Laiho P，Ollikainen M，et al.BRAF screening as a low-cost effective strategy for simplifying HNPCC genetic testing[J].J Med Genet，2004，41：664e8.

[17] Herman JG，Umar A，Polyak K，et al.Incidence and functional consequences of hMLH1 promoter hypermethylation in colorectal carcinoma[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95：6870-6875.

[18] Fallik D，Borrini F，Boige V，et al.Microsatellite instability is a predictive factor of the tumor response to irinotecan in patients with advanced colorectal cancer[J].Cancer Res，2003，63：5738e44.

[19] Sargent D，Marsoni S，Thibodeau SN，et al.Confirmation of deficient mismatch repair（dMMR）as a predictive marker for lack of benefit from 5-FU based chemotherapy in stage II and III colon cancer（CC）：a pooled molecular reanalysis of randomized chemotherapy trials[J].J Clin Oncol，2008，26：4008.

[20] Toyota M，Ahuja N，Ohe-Toyota M，et al.CpG island methylator phenotype in colorectal cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA，1999，96：8681-8686.

[21] Barault L，Charon-Barra C，Jooste V，et al.Hypermethylator phenotype in sporadic colon cancer：study on a population-based series of 582 cases[J].Cancer Res，2008，68：8541e6.

[22] Xiao LX.Methylation profile of the promoter CpG islands of 31 genes that may contribute to colorectal carcinogenesis[J].World J Gastroenterol，2004，10（23）：3441-3454.

[23] Koichi Yagi，Kiwamu Akagi，Hiroshi Hayashi，et al.Three DNA methylation epigenotypes in human colorectal cancer[J].Clin Cancer Res，2010，16：21-33.

[24] Jass JR.Classification of colorectal cancer based on correlation of clinical，morphological and molecular features[J]. Histopathology，2007， 50，113-130.

[25] Yamashita K，Dai T，Dai Y，et al.Genetics supersedes epigenetics in colon cancer phenotype[J].Cancer Cell，2003，4：121-131.

[26] Issa JP.CpG island methylator phenotype in cancer[J].Nat Rev Cancer，2004，4：988-993.

[27] Egger G，Liang G，Aparicio A，et al.Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy[J].Nature，2004，429：457-463.

[28] Laird PW，Jackson Grusby L，Fazeli A，et al.Suppression of intestinal neoplasia by DNA hypomethylation [J].Cell，1995，81（2）：197-205.

[29] Plumb JA，Strathdee G，Shddan J，et al.Reversal dmgresistance in human tumor xenografts by 2'-deoxy-5-azaeytidine-induced demethylation of the hMLHl gene promoter[J].Cancer Res，2000，60：6039-6044.

[30] Matthias Schaefer，Sabine Hagmann，Katharina Hanna，et al.Azacytidine Inhibits RNA methylation at DNMT2 target sites in human cancer cell lines[J].Cancer Res，2009，69：8127-8132.

[31] Davis AJ，Gelmon KA，Siu LL，et al.Phase I and pharmacologic study of the human DNA methyltransferase antisense oligodeoxynucleotide MG98 given as a 21-day continuous infusion every 4 weeks[J].Invest New Drugs，2003，21：85-89.

[32] Winquist E，Knox J，Ayoub JP，et al.PhaseⅡ trial of DNA methyltransferase 1 inhibition with the antisense oligonucleotide MG98 in patients with metastatic renal carcinoma：a national cancer institute of canada clinical trials group investigational new drug study[J].Invest New Drugs，2006，24：159-167.

[33] Stephenson J，Amato RJ，Hotte S，et al.A dose and schedule optimizing evaluation of MG98 given as either a 2 hour IV infusion twice weekly or as a 7 day continuous infusion in combination with interferon alpha （INF）in nephrectomized patients（pts）with advanced renal cell carcinoma（RCC）[J].J Clin Oncol，2006，24（18 suppl）：641s（Abstract 14557）.

[34] Sobin LH，Gospodarowicz MK，Wittekind C.TNM classification of malignant tumors.7th[M].Hoboken：John Wiley Sons，2009：163.

（收稿日期：2012-10-15）