HPLC法測定吳茱萸超微速溶飲片中吳茱萸堿、吳茱萸次堿及檸檬苦素的含量

[摘要] 目的 建立一種同步測定吳茱萸超微速溶飲片中吳茱萸堿，吳茱萸次堿及檸檬苦素含量的高效液相色譜方法。方法 采用Hypersil ODS2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），島津LC-20AD高效液相色譜儀，流動相為乙腈-水-四氫呋喃-冰醋酸（34︰64.7︰1.1︰0.2），流速：1.0 mL/min， 檢測波長：225 nm，柱溫：30℃。 結果 吳茱萸堿、吳茱萸次堿、檸檬苦素進樣量分別在0.101 6～2.032μg（r2=0.999 9，n=6）、0.097 4～1.948μg（r2=0.999 9，n=6）、0.7010～14.02μg（r2=0.999 9，n=6）范圍內與峰面積呈良好線性關系，平均回收率分別為100.37%（RSD=1.29%，n=6）、99.11%（RSD=0.83%，n=6）、99.30%（RSD=0.52%，n=6）。結論 該測定方法簡便，測定結果準確，重復性好，可作為質量控制方法。

[關鍵詞] 吳茱萸堿；吳茱萸次堿；檸檬苦素；HPLC

[中圖分類號] R284 [文獻標識碼] B [文章編號] 2095-0616（2013）01-108-04

吳茱萸為蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecparpa（Juss）. Benth，石虎E.rutaecarpa（Juss.）benth.var.offcinalis（Dode）Huang或疏毛吳茱萸E.rutaecarpa（Juss.）benth.var.Bodinieri（Dode）Huang的干燥近成熟果實，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉等功效[1]。吳茱萸主要有效成分為生物堿類和檸檬苦素類，其中吳茱萸堿和吳茱萸次堿，具有鎮痛和抗炎作用[2]，檸檬苦素具有調節體內膽固醇水平，防止動脈粥樣化和除蟲等作用[3]。吳茱萸經超微粉碎后制成的飲片可提高中藥成分的利用率，減少中藥資源的浪費[4]。本實驗通過對吳茱萸超微速溶飲片的研究，建立了高效液相色譜法測定吳茱萸超微速溶飲片中吳茱萸堿，吳茱萸次堿及檸檬苦素含量的方法。通過試驗證明，由于藥材的超微分化作用，其含量比對應的吳茱萸藥材含量要高。

本研究在制備單味中藥超微速溶飲片工藝中，首次將超微粉碎技術、微波滅菌技術、真空包裝等新技術同步運用到中藥飲片的研究及加工領域，將中藥飲片加工成微米級的顆粒飲片，使中藥飲片從內在質量到外觀包裝都有了新的提高。單味中藥超微速溶飲片，既保留了傳統飲片的特色與優勢，又避免了煎煮的麻煩，且節省藥材、方便服用，是中藥飲片領域的一項創新性工作，這一研制成果對保護藥材資源，促進中藥現代化、產業化具有十分重要的意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀（LC-solution工作站，LC-20AD二元泵，SPD-20A紫外檢測器），SimplicityTM型超純水系統（Millipore公司）；Mettller Tkledo AG135雙量程電子天平（十萬分之一）。

1.2 試藥

吳茱萸堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110802-200606），吳茱萸堿使用前置P2O5干燥器中干燥12 h以上使用；吳茱萸次堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110801-201006）；檸檬苦素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110800-200404）；吳茱萸超微速溶飲片（江西天聚堂中藥飲片有限公司，粒度小于50微米，批號： A1201020822、A1202031583、A1202201997），試驗用乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Hypersil ODS2 C18，250 mm×4.6 mm，5μm（大連依利特公司）；檢測波長為225 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30℃；進樣量為10μL；流動相為乙腈-水-四氫呋喃-冰醋酸（34︰64.7︰1.1︰0.2），流動相超聲脫氣。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取吳茱萸堿對照品10.16 mg、吳茱萸次堿對照品9.74 mg、檸檬苦素對照品7.01 mg，分別置10 mL容量瓶中。在吳茱萸堿與吳茱萸次堿容量瓶中加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取各1 mL，置檸檬苦素容量瓶中加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。C吳茱萸堿=0.101 6 mg/mL，C吳茱萸次堿=0.097 4 mg/mL，C檸檬苦素=0.701 mg/mL（吳茱萸堿對照品使用前置P2O5干燥器中干燥12 h以上使用，吳茱萸堿（C19H17N3O）以99.9%計。

2.2.2 供試品溶液的制備 取吳茱萸超微速溶飲片粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理（功率100 W，頻率40 KHz）40 min，放冷，再稱定重量，用80%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液，即得。

2.3 系統適用性

按“2.1”項下的色譜條件，分別精密吸取混和對照品液（按“2.2.1”項下制備）及供試品溶液（按“2.2.2”項下制備）各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖（圖1、圖2）。結果表明，在該色譜條件下，吳茱萸各色譜峰均獲得較好的分離，檸檬苦素、吳茱萸堿，吳茱萸次堿的保留時間分別約為16.715 min、30.437 min和 36.464 min，分離度良好。理論塔板數按檸檬苦素峰計算應不低于3 000。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取上述混合對照品溶液1、2、5、10、15、20μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項下的色譜條件進樣測定。以對照品進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標（Y）繪制標準曲線，計算回歸方程。見表1～3。研究結果表明吳茱萸堿的回歸方程為Y=1.0×107X+39 765，r2= 0.999 9；吳茱萸次堿的回歸方程為 Y=3.8×106X-4 130.1 ，r2=0.999 9；檸檬苦素的回歸方程為 Y=1.1×105X-873.07，r2=0.999 9；結果表明吳茱萸堿在0.101 6～2.032μg之間線性范圍良好，吳茱萸次堿在0.097 4～1.948μg之間線性范圍良好，檸檬苦素在0.701 0～14.02μg之間線性范圍良好。

2.5 精密度試驗

取同一份吳茱萸超微速溶飲片供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，每次10μL，記錄峰面積。結果吳茱萸堿，吳茱萸次堿，檸檬苦素的RSD分別為2.33%、1.79%、1.61%（n=6）。見表4。表明精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批吳茱萸超微速溶飲片（批號：A1202031583）按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，精密吸取10μL，注入液相色譜儀，按外標法以峰面積計算。結果吳茱萸堿，吳茱萸次堿，檸檬苦素的RSD分別為0.65 %、0.98%、0.61%（n=6），見表5。表明本方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取同一份吳茱萸超微速溶飲片（批號：A1202031583）供試品，分別于0、2、4、8、12、24 h測定，記錄峰面積，結果吳茱萸堿，吳茱萸次堿，檸檬苦素的RSD分別為1.00%、1.23%、1.78%（n=6），見表6。結果表明，供試品在24 h內穩定。

2.8 加樣回收試驗

取已知各成分含量的吳茱萸超微速溶飲片粉末6份，精密稱取0.25 g，分別精密加入一定量的吳茱萸堿對照品，吳茱萸次堿對照品和檸檬苦素對照品，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測定，計算回收率，結果見表7～9。吳茱萸堿，吳茱萸次堿及檸檬苦素的平均回收率（n=6）分別為100.37%（RSD=1.29%）；99.11%（RSD=0.83%）；99.30%（RSD=0.52%）。

2.9 樣品含量測定

取3批吳茱萸超微速溶飲片約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依次進樣，記錄峰面積。混合對照品溶液按“2.2.1”項下方法制備，用外標法計算3種成分的含量，3批樣品含量測定結果見表10。

3 討論

本品含量測定參照《中華人民共和國藥典》2010年版一部第160頁吳茱萸藥材項下的有關規定進行檢驗，發現用藥典中的流動相比例進行進樣時，3種成分的分離效果不太好，所以對流動相進行了適當的調整，調整后達到了較好的分離。此方法可以作為本品質量控制方法。

吳茱萸藥材加工成超微速溶飲片后，在相同的提取條件下進行含量測定，超微速溶飲片中的各成分含量較藥材中提高，3組吳茱萸超微速溶飲片中吳茱萸堿，吳茱萸次堿，檸檬苦素的平均含量分別是0.442%、0.315%和1.687%；3組吳茱萸藥材中吳茱萸堿，吳茱萸次堿，檸檬苦素的平均含量分別是0.384%、0.280%和1.542%；這說明經加工后的超微速溶飲片中有效成分溶出率有提高；另相同條件下測定超微速溶飲片浸出物含量也有所提高，吳茱萸超微速溶飲片浸出物檢查結果32.32%吳茱萸藥材中浸出物檢查結果30.89%。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].北京：中國醫藥科技出版社，2010：160.

[2] 戰光緒，吳大正，胡之壁，等.吳茱萸有效成分的藥理研究進展[J].上海中醫藥雜志，2006，40（2）：62.

[3] 施英，徐玉娟，陳衛東，等.桔核中檸檬苦素類物質最佳提取條件的探討及清除DPPH活性的研究[J].食品與機械，2006，22（6）：74.

[4] 蔡光先，楊永華，李躍輝.超微粉碎技術與中藥飲片改革[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2004，6（2）：67-70，87.

（收稿日期：2012-11-05）