枸杞多糖對2型糖尿病大鼠胰腺β細(xì)胞PDX—1基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要] 目的 探討枸杞多糖對2型糖尿病大鼠β細(xì)胞分泌功能及PDX-1基因mRNA表達(dá)的影響。 方法 用高糖飼喂并結(jié)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)制備2型糖尿病大鼠模型，分組灌胃給予不同濃度的枸杞多糖及對照藥物， 50只實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組：對照組、模型組、模型+30 mg/kg LBP組、模型+60 mg/kg LBP組、模型+ 90 mg/kg LBP組。連續(xù)8周后檢測空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清胰島素，處死大鼠取胰腺組織，RT-PCR檢測β細(xì)胞內(nèi)PDX-l及胰島素mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果 2型糖尿病大鼠胰腺β細(xì)胞PDX-l及胰島素mRNA的表達(dá)水平顯著下降（P<0.01）；60 mg/kg和90 mg/kg LBP組能顯著上調(diào)2型糖尿病大鼠胰腺β細(xì)胞PDX-l與胰島素mRNA表達(dá)水平（P<0.05）。 結(jié)論 LBP可以通過上調(diào)PDX-l和胰島素mRNA表達(dá)，改善2型糖尿病大鼠β細(xì)胞胰島素合成和分泌功能的損傷。

[關(guān)鍵詞] 枸杞多糖；2型糖尿病；β細(xì)胞；PDX-1

[中圖分類號] R587.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）01-34-04

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一個復(fù)合病因的綜合病癥，是由于體內(nèi)胰島素缺乏或拮抗胰島素的激素增加，或胰島素在靶細(xì)胞內(nèi)不能發(fā)揮正常生理作用而引起的葡萄糖、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)代謝紊亂的一種綜合征，長期高血糖、高血脂導(dǎo)致β細(xì)胞功能衰退、胰島素分泌缺陷的發(fā)生，是糖尿病的重要特征[1]。2型糖尿病病因極為復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，大量研究表明胰島素抵抗和胰島素的分泌缺陷是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[2]。所以尋求既可以降糖，同時又能保護(hù)β細(xì)胞，阻止其損傷與功能衰退，增加胰島素分泌的有效藥物是糖尿病治療的關(guān)鍵。

枸杞為茄科植物寧夏枸杞（Lycuim barbarum L.）干燥的成熟果實(shí)，是一味傳統(tǒng)常用的中藥，其中主要有效成分為枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）[3]。大量藥理及臨床研究表明，LBP是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑，它能多途徑、多層面調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)。LBP具有多種生物活性，具有抗衰老[4-5]、抗應(yīng)激[6]、抗腫瘤[7-8]、保肝[9]、降血脂[10]、雙向調(diào)節(jié)血糖[11-12]等功用，對機(jī)體毒副作用小，具有廣闊的開發(fā)前景。

胰島β細(xì)胞的凋亡是2型糖尿病重要的發(fā)病機(jī)制，PDX-1（pancreatic duodenal homeobox-1）是胰島素基因轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育、分化起著重要的作用。它參與了一系列與維持β細(xì)胞特性和功能有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[13]。本研究以高糖誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠為研究對象，觀察LBP對高糖誘導(dǎo)的胰腺β細(xì)胞胰島素的分泌情況及PDX-1 mRNA表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠50只，約2月齡，體重（200±20） g，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，在動物中心SPF級動物房喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

LBP瓶裝干粉購自浙江方格藥業(yè)有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ，Sigma公司）；檸檬酸（Sigma公司）；胰島素及胰高糖素檢測試劑盒購自天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；即用型PCR擴(kuò)增試劑盒購自Fermentas公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 糖尿病動物模型的建立

參照文獻(xiàn)方法[15]稍作修改。SPF級雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取8只作為正常對照組，其余大鼠用高糖高脂飼料（飼料自制，組成為：10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1.0%膽酸鈉，66.5%常規(guī)飼料）喂養(yǎng)30 d。鼠空腹12 h以上，鏈脲佐菌素溶于過濾除菌的0.05 mmol/L，pH=4.5的檸檬酸緩沖液。將STZ按照190 mg/kg體重劑量以腹腔注射（i.p.）的方式在5 min內(nèi)注射完畢，72 h后剪尾采血檢測血糖，以血糖>16.7 mmol/L為成功模型納入實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

將造模成功的40只大鼠按血糖值、體重隨機(jī)分為4組：模型對照組（水灌胃）及LBP高、中、低劑量組（90、60、30 mg/kg LBP灌胃）。定期稱量體重調(diào)整給藥量，1次/d，連續(xù)8周。

1.5 動物處理

給藥結(jié)束后，將大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（45 mg/kg）進(jìn)行麻醉，股動脈取血分離血清，用于血生化指標(biāo)檢測。在胰頭部位剪取適量胰腺組織于-80℃保存，用于檢測PDX-1及胰島素mRNA表達(dá)水平。

1.6 血生化指標(biāo)測定

空腹血糖（FBG）、三酰甘油（triglyeride，TG），總膽固醇（total cholesterol，TC），高密度脂蛋白（hish density lipoprotein，HDL），低密度脂蛋白（10w density lipoprotein，LDL）由HITACH717全自動生化分析儀測定。空腹胰高血糖素（fasting plasma glucagon，F(xiàn)PG）和FSI水平按照試劑盒要求檢測。

1.7 RT-PCR檢測

胰腺總RNA抽取采用TRizol一步法，按試劑盒要求操作，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PDX-1的引物序列：上游引物5’-GCGAGGAGCTGCTGGCATTG-3’，下游引物5’-CCAACTGGCTCTTGTGCCCCC-3’；胰島素的引物序列：上游引物5’-ACACACCCAAGTCCCGTCGTG-3’，下游引物5’-GGGGAGTGGTGGACTCAGTTGC-3’；GADPH的引物序列：上游引物5’-ACCCGCCACCAGTTCGCCAT-3’，下游引物5’-TGACCCCGTCTCCGGAGTCCAT-3’，于美國生物醫(yī)學(xué)中心基因庫（GeneBank）中檢索設(shè)計。循環(huán)步驟如下：94℃預(yù)變性5 min，（94℃變性30 s，退火：PDX-1 55℃，胰島素58℃；GADPH 57℃，35 s，72℃延伸35s）×35次循環(huán)，15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，EB染色，分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為DNA maker DL2000，凝膠圖像分析系統(tǒng)對RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶進(jìn)行密度分析，以GAPDH為內(nèi)參，計算PDX-1和胰島素基因的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LBP對PDX-1和胰島素mRNA表達(dá)的影響

PDX-1和胰島素基因在2型糖尿病模型大鼠胰腺組織中的表達(dá)量顯著降低（P<0.01），60 mg/kg與90 mg/kg LBP組PDX-l mRNA表達(dá)較模型組有明顯上升（P<0.01），60 mg/kg LBP組胰島素mRNA的表達(dá)上升最顯著（P<0.01）。見圖1。30 mg/kg LBP組與模型組比較，PDX-1和胰島素mRNA表達(dá)的增加差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 LBP對大鼠血生化指標(biāo)的影響

糖尿病模型組空腹血糖與胰島素水平均較對照組有明顯升高（P<0.05或P<0.01）；不同濃度LBP組與糖尿病模型組比較，空腹血糖水平顯著下降（均P<0.05），但與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；不同濃度LBP組胰島素水平較糖尿病模型組也顯著下降（P<0.05或P<0.01）。見表1。

3 討論

隨著人們生活方式的改變，尤其是高能量食品的攝入過多及體力活動減少，糖尿病的發(fā)病率大幅上升，嚴(yán)重危害到人們身體的健康[16]，其中以2型糖尿病患者居多。據(jù)WHO報告，預(yù)計到2025年全球20～79歲糖尿病患者將達(dá)到3.33億人[17]。與西方人群相比，我國2型糖尿病患者發(fā)病更早，β細(xì)胞功能受損更早且更嚴(yán)重[18-19]，其增長速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過發(fā)達(dá)國家。

PDX-l是調(diào)控胰島素基因轉(zhuǎn)錄、胰島素顆粒成熟和分泌的重要轉(zhuǎn)錄因子[20]，它通過結(jié)合胰島素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)A3而激活其轉(zhuǎn)錄過程，上調(diào)胰島素表達(dá)水平。此外，在胰島素mRNA轉(zhuǎn)錄水平不變的情況下，PDX-l的高表達(dá)能提高細(xì)胞間胰島素含量。因此，PDX-l決定著胰島素基因的啟動、表達(dá)和增強(qiáng)效應(yīng)，同時也調(diào)控著胰島素的成熟和分泌過程-，在胰腺早期發(fā)育、較晚期β細(xì)胞的分化以及β細(xì)胞維持正常功能中起著重要作用[22-23]。

枸杞作為一味常用傳統(tǒng)中藥，臨床使用歷史已相當(dāng)久遠(yuǎn)。在倡導(dǎo)中藥現(xiàn)代化的今天，枸杞多糖作為枸杞的主要活性成分日益得到重視。許多研究表明，枸杞多糖是枸杞子調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老的主要活性成分，并具有降血脂[24]、抗脂肪肝[25]、抗衰老等作用。近年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖還具有降糖[26]、降脂、改善胰島素抵抗[27]等作用，提示枸杞多糖對糖尿病具有一定的防治作用。本研究結(jié)果顯示，LBP可以通過上調(diào)PDX-l和胰島素mRNA表達(dá)，改善2型糖尿病大鼠β細(xì)胞合成和分泌胰島素的功能，保護(hù)β細(xì)胞的功能。枸杞多糖既有豐富的生物學(xué)活性，又無毒副作用，無論在臨床運(yùn)用還是保健類食品開發(fā)方面都有著廣闊的前景，所以對枸杞多糖的深入研究的開發(fā)具有十分重要的意義。

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（收稿日期：2012-11-26）