蟾毒靈抗肝細(xì)胞癌作用及機(jī)制研究

[摘要] 肝細(xì)胞癌早期診治困難，手術(shù)切除率低，放化療療效差，蟾毒靈是蟾酥中抗腫瘤作用最強(qiáng)蟾毒配基，蟾毒靈對(duì)人正常細(xì)胞沒(méi)有作用，而對(duì)肝癌細(xì)胞具有明顯的殺傷，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。本文從蟾毒靈抗肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)作用及其相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行論述，說(shuō)明蟾毒靈在肝細(xì)胞癌治療中重要意義和研究前景。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞癌；蟾毒靈；治療；機(jī)制

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）01-60-03

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），簡(jiǎn)稱肝癌，在我國(guó)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率在惡性腫瘤中居第3位，僅次于胃癌和食管癌，每年有600 000死于肝癌，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。目前原發(fā)性肝癌的治療首選手術(shù)切除，我國(guó)原發(fā)性肝癌患者常伴有不同程度的肝硬變，發(fā)生率為70%～90%，在肝硬變基礎(chǔ)上切除腫瘤手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)大，由于硬變的肝臟對(duì)缺血和失血極為敏感，長(zhǎng)時(shí)間的入肝血流阻斷和大量失血，極易導(dǎo)致術(shù)后急性肝功能衰竭，手術(shù)切除率為15%～20%[2-3]。Ziser等[4]發(fā)現(xiàn)肝硬變患者接受各種手術(shù)治療，其圍手術(shù)期（術(shù)后30 d內(nèi)）并發(fā)癥發(fā)生率為30.1%，死亡率為11.6%。肝癌全身靜脈化療療效差，肝癌局部化療（如肝動(dòng)脈、門靜脈置管介入化療）面臨著肝癌細(xì)胞多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）的問(wèn)題，MDR是肝癌化療失敗的重要原因[5-6]。因此研制和開(kāi)發(fā)新型抗肝癌藥物是提高肝癌治療療效，延長(zhǎng)患者生存期的關(guān)鍵所在。

蟾毒靈（bufalin）來(lái)源于兩棲綱蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍、黑眶蟾蜍或花背蟾蜍等的耳后腺及背部皮膚腺分泌的白色漿液，是從中藥蟾酥中提取的蟾毒配基之一，屬于細(xì)胞拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑，疏水性較強(qiáng)。蟾蜍毒素具有強(qiáng)烈毒性，以毒攻毒之功效，蟾毒靈是蟾酥中抗腫瘤作用最強(qiáng)蟾毒配基，蟾毒靈對(duì)人正常細(xì)胞沒(méi)有作用，而對(duì)肝癌細(xì)胞具有明顯的殺傷，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞周期阻滯及促凋亡作用[7]。本文結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，針對(duì)蟾毒靈在肝癌治療中作用及其機(jī)制加以論述。

1 蟾毒靈抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（topoisomeraseII，topoⅡ）是調(diào)節(jié)生物體雙鏈DNA超螺旋解旋及重新聚合狀態(tài)的相互切換的關(guān)鍵酶，廣泛存在于生物體，與DNA復(fù)制以及染色體的凝集關(guān)系非常密切。Hashmioto等[8]發(fā)現(xiàn)蟾毒靈可引起TopoⅡ-a mRNA的下降導(dǎo)致TopoⅡ-a數(shù)量和活性的下降，且這種現(xiàn)象早于凋亡特征之一，DNA斷裂的發(fā)生。Watabe等[9]發(fā)現(xiàn)酪蛋白激酶2在蟾毒靈的作用下從胞漿移位到細(xì)胞核內(nèi)，與TopoⅡα形成復(fù)合物后調(diào)節(jié)該酶的活性，使拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ活性下降，表明蟾毒靈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)抑制TopoⅡ活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。蘇永華等[10]將蟾毒靈作用于SMMC-7721和BEL-7402細(xì)胞后錐蟲(chóng)藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)不同濃度蟾毒靈對(duì)人肝癌細(xì)胞細(xì)胞膜具有破壞作用。顧偉等[11]研究蟾毒靈對(duì)BEL-7402肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用呈濃度-時(shí)間依賴性，將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，電鏡觀察到典型的細(xì)胞凋亡特征。Bcl-2基因?qū)?xì)胞凋亡具有關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用，其表達(dá)蛋白位于核膜、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體膜上，是一種對(duì)細(xì)胞凋亡具有明顯抑制作用的癌基因[12]。Kawazoe等[13]通過(guò)研究蟾毒靈對(duì)腫瘤細(xì)胞膜點(diǎn)位的影響及其與Bcl-2關(guān)系后發(fā)現(xiàn)其對(duì)Na+-K+-ATP酶的抑制作用于Bcl-2蛋白的上游，通過(guò)減少Bcl-2蛋白表達(dá)而起到誘導(dǎo)凋亡作用。Qi等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)蟾毒靈在使肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，不僅可以使Δψm下降，細(xì)胞色素c釋放、caspase-9、caspase -3激活 及PARP從116 kDa 裂解到89 kDa增加，而且發(fā)現(xiàn)Fas蛋白及caspase-8、caspase-10激活增加。使用caspase抑制劑后發(fā)現(xiàn)蟾毒靈的促凋亡作用可以被阻斷，特別是當(dāng)caspase-10被抑制后阻斷凋亡作用明顯。提示蟾毒靈致肝癌細(xì)胞凋亡的作用與Fas蛋白介導(dǎo)的caspase-8/-10依賴的途徑有關(guān)，而且其中FAS介導(dǎo)的caspase-10依賴途徑可能起到更關(guān)鍵的作用。JNK MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路參與許多細(xì)胞凋亡的發(fā)生 ，活化的JNK主要通過(guò)影響相關(guān)基因表達(dá)和線粒體的功能介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，張寧等[15]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蟾毒靈可以通過(guò)增加JNK1/2的磷酸化水平而激活JNK MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，使肝癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是磷酸化反應(yīng)激活的JNK從胞漿移位至細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子c-Jun，ATF-2，ELK-1等的磷酸化促進(jìn)相應(yīng)基因的表達(dá)及新蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)及引起細(xì)胞凋亡。Rel/NF-κB家族是一種重要的核轉(zhuǎn)錄激活因子，參眾多基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，與腫瘤細(xì)胞的耐藥和抗凋亡作用密切相關(guān)[16]。韓克起等[17]采用[γ32-P]ATP 標(biāo)記特異性 NF-κB 寡核苷酸探針用 EMSA 法檢測(cè)不同濃度蟾毒靈處理BEL-7402 細(xì)胞核提取物中的活性變化發(fā)現(xiàn)24 h后NF-κB 輕度活化，48 h后時(shí)明顯活化，有時(shí)間依賴性，提示在蟾毒靈誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中，NF-κB可能具有促進(jìn)凋亡作用，或者雖有抑制凋亡作用，但抑制凋亡的作用弱于蟾毒靈促進(jìn)凋亡作用。顧偉等[18]通過(guò)建立裸鼠人肝癌原位移植瘤模型，體內(nèi)分別應(yīng)用蟾毒靈高（1.5 mg/kg）、中（1 mg/kg）、低（0.5 mg/kg）劑量、阿霉素8 mg/kg，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟾毒靈使腫瘤體積明顯縮小，病理檢查高、中劑量組癌灶內(nèi)有大量纖維結(jié)締組織增生，肝癌組織以中重度壞死為主，壞死灶主要集中在腫瘤中央部位。電鏡觀察到肝癌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，胞漿濃縮，染色質(zhì)濃集于核膜內(nèi)側(cè)呈團(tuán)塊或新月?tīng)睿麧{起泡和凋亡小體，并見(jiàn)凋亡小體脫離細(xì)胞體，沒(méi)入間質(zhì)或被其他細(xì)胞吞飲。蟾毒靈低、中、高劑量組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)分別明顯高于阿霉素組，且高劑量蟾毒靈抑瘤率顯著高于阿霉素，顯著延長(zhǎng)荷瘤裸鼠平均生存期。

2 蟾毒靈逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞多藥耐藥

肝癌是臨床常見(jiàn)的對(duì)化療不敏感的惡性腫瘤，研究證實(shí)MDR現(xiàn)象是肝癌化療無(wú)效或漸失效的主要原因。顧偉等[18]用誘導(dǎo)法建立BEL7402/5-Fu耐藥細(xì)胞株，將0.005、0.001、0.000 2μmol/L 3個(gè)濃度的蟾毒靈作為逆轉(zhuǎn)劑對(duì)肝癌細(xì)胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)三個(gè)濃度的蟾毒靈作用72 h均顯示出一定的逆轉(zhuǎn)耐藥作用，其中0.005μmol/L的蟾毒靈的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)強(qiáng)于1μmol/L的傳統(tǒng)用于逆轉(zhuǎn)耐藥的鈣通道阻滯劑維拉帕米，其逆轉(zhuǎn)作用是維拉帕米的1.66倍。為了研究奇逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制，用多藥耐藥相關(guān)蛋白（multi-drug resistance associated porotein，MRP）的底物熒光素對(duì)BEL7402/5-Fu耐藥細(xì)胞株研究后認(rèn)為蟾毒靈可能對(duì)BEL7402/5-Fu耐藥細(xì)胞具有雙相作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡濃度（>0.01μmo/lL）的蟾毒靈可通過(guò)激活P38MAPK繼而上調(diào)MRP1的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥，在低細(xì)胞毒濃度（0.001μmol/L）蟾毒靈則可能通過(guò)其他途徑下調(diào)MRP1的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)耐藥。研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致其耐藥機(jī)制包括多個(gè)方面，包括藥物轉(zhuǎn)運(yùn)泵MRP1參介導(dǎo)的藥物外排，Bcl-xL的高表達(dá)改變了的細(xì)胞凋亡Bcl-xl/Bax的比值，肝癌組織中胸苷酸合酶表達(dá)增加，耐藥細(xì)胞株中E-鈣黏合素表達(dá)增加使細(xì)胞間黏附增加有關(guān)。孟曉燕等[19]用蟾毒靈誘導(dǎo)耐藥Bel-7402肝癌細(xì)胞凋亡，且呈濃度依賴性；在BUF 0.01～1.00μmol/L范圍內(nèi)，隨藥物作用濃度升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高。BUF通過(guò)阻滯肝癌細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)人肝癌MDR細(xì)胞株BEL-7402/5-FU的抑制作用，人肝癌MDR細(xì)胞株BEL-7402/5-FU對(duì)BUF沒(méi)有耐藥性，表明BUF能夠逆轉(zhuǎn)耐5-FU藥物的肝癌細(xì)胞MDR。

3 蟾毒靈抑制肝癌血管新生

腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲均離不開(kāi)血管的新生，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增值是血管新生中非常重要的環(huán)節(jié)。肝癌血供豐富，是一個(gè)高度血管化的惡性腫瘤，其生長(zhǎng)和代謝需要持續(xù)的血管生成，肝癌的血管新生化與其生物學(xué)特性包括高度血管浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移傾向，并導(dǎo)致該疾病的預(yù)后不良[20]。蟾毒靈不但對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)也具有明顯抑制作用。Lee等[21]用5、10、20 nM的蟾毒靈分別作用于牛大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞5 d后發(fā)現(xiàn)牛大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)分別被抑制了45.3%、62.8%、和75.6%。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，蟾毒靈對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞也有同樣的抑制作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蟾毒靈可以使G0/G1和S期內(nèi)皮細(xì)胞減少，而阻滯在G2/M期細(xì)胞增加。翟笑楓等[22]采用MTT法測(cè)定蟾毒靈對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304生長(zhǎng)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)蟾毒靈對(duì)ECV304細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，且呈濃度和時(shí)間的依賴性。24、48、72 h 的IC50分別為 1.104、0.355、0.090 5μg/mL，蟾毒靈具有明確的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抗血管生成的作用。

4 蟾毒靈抗肝癌存在問(wèn)題與展望

近年來(lái)多激酶靶向抑制劑如索拉菲尼已被推薦為治療晚期肝癌的一線用藥，收到了較好的治療效果[23-24]。與索拉菲尼相比，Gao等[25]研究發(fā)現(xiàn)蟾毒靈對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)于索拉菲尼，索拉菲尼抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有劑量依賴性，肝癌細(xì)胞HepG2的IC50為3565.7nmol/L，蟾毒靈對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的IC50為157.87 nmol/L。蟾毒靈口服吸收后與人血漿蛋白結(jié)合率約為97% ， 屬于高血漿蛋白結(jié)合，只有少部分游離藥物作為活性藥物分子參與體內(nèi)藥理效應(yīng)。因蟾毒靈對(duì)心血管系統(tǒng)具有類似洋地黃樣強(qiáng)心作用，高于10-7 mol/L的濃度對(duì)心血管系統(tǒng)具有毒副作用，限制了臨床高劑量應(yīng)用[26-27]。蟾毒靈具有廣譜的抗癌作用，但其心臟毒性、猝死、低水溶性等缺點(diǎn)，限制了蟾毒靈的臨床應(yīng)用[28-30]。隨著物理學(xué)、化學(xué)、材料學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，納米技術(shù)被越來(lái)越多的用到藥物治療上，納米載體的應(yīng)用不僅能夠提高藥物生物可利用度，而且改進(jìn)藥物的時(shí)間控制釋放性能和藥物靶向精確定位釋藥，從而降低藥物全身毒副作用，相信不久的將來(lái)，隨著蟾毒靈新劑型不斷問(wèn)世，將造福于廣大肝癌患者。

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（收稿日期：2012-12-06）