耐低溫兼性厭氧蛋白酶產(chǎn)生菌192的篩選、鑒定及酶學性質(zhì)

摘要： 為了提高厭氧水解效率，采用雙層平板法篩選出一株耐低溫兼性厭氧蛋白酶產(chǎn)生菌192。經(jīng)形態(tài)、生理生化和16S rDNA序列分析鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），對其產(chǎn)酶條件進行了初步研究。結(jié)果表明，該菌的最適生長溫度為30 ℃，生長8～12 h達對數(shù)期，初始pH 7.5時酶活力最高。蛋白酶最適反應溫度為45 ℃、pH 7.0，酶活力最高達39.3 U/mL。該酶在50 ℃以下，pH 6.0～9.0性能穩(wěn)定。在60 ℃以上熱穩(wěn)定性很差，70 ℃保存1 h酶活力全部喪失。

關(guān)鍵詞：兼性厭氧；耐低溫蛋白酶；蠟狀芽孢桿菌；酶學性質(zhì)

中圖分類號：Q93-331；Q556 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）04-0807-04

Screening and Identification of Psychrotolerant and Anaerobic Protease-Producing Strain and Characterization of Protease

CUI Guan-hui1，2，XI Yan-hua1，2，CHENG Hui-cai1，2，ZHANG Li-ping1，2，HUANG Ya-li1，2，MA Jin-liang1，3

（1. Institute of Biology， Hebei Academy of Sciences， Shijiazhuang 050081， China；

2. Main Crops Disease of Microbial Control Engineering Technology Reseach Center in Hebei Province， Shijiazhuang 050081， China；

3. College of Life Sciences， Hebei University， Baoding 071002， Hebei， China）

Abstract： In order to improve the efficiency of the anaerobic hydrolysis， the psychrotolerant and anaerobic protease-producing strain 192， was screened using double-plate method. The strain was identified as Bacillus cereus based on the results of morphological， physiological， biochemical and 16S rDNA analysis. Then its optimal protease-producing conditions were studied. The results showed that the optimum growth temperature of this strain was 30 ℃ and its enzyme activity was highest when the initial pH 7.5， after 8～12 h of growth. The optimal reaction condition of this protease was 45 ℃ and pH 7.0， its enzyme activity could be up to 39.3 U/mL. At the conditions of pH 6.0～9.0 and lower than 50 ℃， the protease was stable. The protease was unstable at the temperature higher than 60 ℃， it would completely lose activiy when storing at 70 ℃ for 1 h.

Key words： facultative anaerobic； psychrotolerant protease； Bacillus cereus； enzymatic properties

蛋白酶是一類重要的水解酶，占酶制劑市場的65%以上，除在食品、飼料、添加劑、洗滌、皮革、環(huán)保等領(lǐng)域外，在厭氧消化系統(tǒng)中加入蛋白酶，不僅對有機物的去除有作用，而且對厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷也有促進作用[1-3]。Rademacher等[4]通過添加多種酶來提高厭氧污泥消化速率。Scheidat等[5]在初沉池污泥中加入蛋白酶、糖化酶和脂肪酶，發(fā)現(xiàn)均能明顯地提高水解作用。Romano等[6]研究表明，添加水解酶后，沼氣產(chǎn)率從0.35 L/g增加到0.53 L/g，甲烷產(chǎn)率從0.15 L/g增加到0.29 L/g。低溫蛋白酶具有低溫高催化效率等特性，有著中溫、高溫蛋白酶無法取代的優(yōu)越性。因此，從過冬污泥中分離出一株耐低溫的兼性厭氧蛋白酶產(chǎn)生菌，并對其生理生化和酶學性質(zhì)等進行了初步研究，以期為其應用于污水處理及厭氧發(fā)酵、提高水解效率和沼氣產(chǎn)氣率提供菌種和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 樣品采自不同厭氧環(huán)境的沼渣沼液、池塘污泥、生活污水等。

1.1.2 培養(yǎng)基 初篩培養(yǎng)基：瓊脂粉1.2%，脫脂奶粉1%，pH自然。復篩培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 7.2。水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉1.2%、pH自然。

1.2 方法

1.2.1 富集培養(yǎng) 將所取樣品加入富集培養(yǎng)基中，在（15±1） ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。

1.2.2 初篩 稱取樣品10 g用生理鹽水按10倍稀釋法稀釋至10-8。分別取10-5～10-8稀釋液1mL置于平板中，倒入牛奶培養(yǎng)基，搖勻。待培養(yǎng)基凝固后，倒入水瓊脂培養(yǎng)基。置于（15±1） ℃培養(yǎng)3～5 d，挑取水解圈直徑較大的菌株，穿刺保存。將初步選出的菌株在初篩培養(yǎng)基上再進一步進行培養(yǎng)、比較、篩選出透明圈較大的菌株，進行復篩。

1.2.3 復篩 采用國家輕工行業(yè)標準QB1805.3-1993中的Folin-酚法測定蛋白酶活力[7]。酶活力定義為1 mL酶液在pH 7.0、40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為一個酶活力單位，以U/mL表示。

1.2.4 菌株鑒定

1）形態(tài)觀察。采用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察菌體的形態(tài)特征。

2）生理生化鑒定。生理生化鑒定參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]。

3）16S rDNA序列分析。以細菌基因組總DNA為模板， 以細菌通用引物進行PCR擴增16S rDNA序列，提交GenBank數(shù)據(jù)庫，并與GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，采用DNAMAN軟件進行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9]。

1.2.5 產(chǎn)酶條件及酶學性質(zhì)分析

1） 生長曲線及最佳產(chǎn)酶時間的測定。在pH 7.5，溫度（15±1） ℃情況下培養(yǎng)，接種后每隔2 h取樣測定OD660 nm，繪制菌株生長曲線。

2） 初始 pH和不同培養(yǎng)溫度對酶活力的影響。將培養(yǎng)基pH設定為4.5～9.5，以0.5為1個梯度，測定各個pH下的酶活力，確定其最適pH。設定培養(yǎng)生長溫度分別為4、16、22、30、37、45、55 ℃，測定各個培養(yǎng)溫度下的蛋白酶活力，確定最適生長溫度。

3） 酶學性質(zhì)分析。分別對酶的最適反應溫度、pH和酶的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性進行研究，具體方法參見文獻[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選結(jié)果

在（15±1） ℃培養(yǎng)72 h后，初篩培養(yǎng)基上可以觀察到一部分菌株周圍產(chǎn)生肉眼可見的水解圈，根據(jù)菌落大小、形態(tài)、顏色和水解圈的大小，共挑取374個菌株穿刺培養(yǎng)保存。通過三點法3次考查，最終得到58株透明圈相對較大的菌株，其中有17株透明圈直徑與菌落直徑比值≥3（圖1），對其進行復篩，結(jié)果（表1）表明，菌株192酶活力最高，達到35.5 U/mL，且在重復的試驗中，該菌株產(chǎn)生的酶活力穩(wěn)定。因此，選菌株192作為出發(fā)菌株，對其進行菌種鑒定及產(chǎn)酶特性研究。

2.3 菌株192的形態(tài)特征觀察結(jié)果

菌株192菌落呈白色、圓形、光滑、濕潤、不透明、菌落邊緣整齊；菌株長約 1.9～4.0 μm，寬度約 0.8～1.1 μm，革蘭氏陽性、桿狀、形成芽孢，芽孢橢圓形或柱形，具體見圖2。

2.4 菌株192的生理生化特性分析結(jié)果

分別對菌株192進行了V-P測定、接觸酶、厭氧生長、淀粉水解、酪氨酸水解、吲哚、發(fā)酵產(chǎn)酸等試驗，結(jié)果見表2。

2.5 16 S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

以菌株192基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到一個長度約為1.5 kb的特異DNA片段，將該PCR產(chǎn)物送北京天根生物制品有限公司進行測序。經(jīng)過16 S rDNA序列對比，發(fā)現(xiàn)菌株192為芽胞桿菌屬（Bacillus sp.），與Bacillus cereus的同源性最高，達到99%（圖3）。經(jīng)過形態(tài)、生理生化特性、16 S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析等確定菌株192為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.6 產(chǎn)酶條件及酶學性質(zhì)分析結(jié)果

2.6.1 菌株192生長曲線和最佳產(chǎn)酶時間 由圖4可知，菌體生長0～6 h為延滯期，在6～12 h為對數(shù)生長期，12 h時達到穩(wěn)定期，22 h后開始衰退。由圖5可知，隨時間變化蛋白酶活力迅速提高，72 h時產(chǎn)酶活力最高，達37.2 U/mL。蛋白酶活力最高與生長最適時間并不一致，其原因可能為所測蛋白酶在培養(yǎng)過程中有累積作用。

2.6.2 初始pH和培養(yǎng)溫度對蛋白酶活力的影響 培養(yǎng)基不同初始pH對菌株所產(chǎn)蛋白酶活力的影響見圖6。由圖6可知，菌株192產(chǎn)蛋白酶的pH范圍較寬，pH 5.5～8.5條件下酶活力均在15 U/mL以上，初始pH為7.5時酶活力最高，達到37.5 U/mL。培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶影響較大（圖7），在16～37 ℃酶活力均大于20 U/mL，30 ℃時酶活力最高，10 ℃以下和45 ℃以上均沒有測到酶活力，說明該菌株適宜在偏低溫和中溫條件下產(chǎn)酶，在高溫或低溫時酶活力喪失，產(chǎn)酶溫度范圍相對狹窄。

2.6.3 反應溫度和pH對酶活力的影響 由圖8可知，菌株192所產(chǎn)蛋白酶最適反應溫度為45 ℃，高于或低于45 ℃酶活力均降低，說明該酶為一種中高溫酶，反應溫度以37～50 ℃為宜。pH對酶活性的影響見圖9，該酶最適反應pH為7.0左右，在pH 5.5～8.0都具有較高的酶活力。由此可知該酶pH適用范圍較寬，具有廣闊的應用前景。

2.6.4 菌株192所產(chǎn)蛋白酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性 該酶在中性、偏堿性環(huán)境中比在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性好，pH 4.0時蛋白酶很快失活，pH 6.0～9.0時穩(wěn)定性相對較好（圖10）。由圖11可知，30、40 ℃保溫30 min對酶活力無任何影響，50 ℃保溫后酶活力略有下降，當超過60 ℃時酶活力急劇下降，70 ℃酶活力全部喪失。說明該酶在50 ℃以下相對安全。

3 結(jié)論

產(chǎn)低溫堿性蛋白酶微生物主要集中在一些極端環(huán)境中，如深海、冰川、高山、南極和北極的水或泥中，主要有假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、異單胞菌屬（Alteromonas）等[11，12]，主要用于洗滌、制革、飼料等工業(yè)生產(chǎn)，將低溫蛋白酶產(chǎn)生菌用于沼氣厭氧發(fā)酵提高水解效率的報道很少。此次篩選到的蠟狀芽孢桿菌192為兼性厭氧菌，來源于過冬污泥， 16～37 ℃生長，其蛋白酶活力均大于20 U/mL，30 ℃時酶活力最高，適宜于偏低溫和中溫條件下產(chǎn)酶。生長6～12 h為對數(shù)生長期，12 h時達到穩(wěn)定期，72 h時產(chǎn)酶活力最高，在最適培養(yǎng)條件及反應條件下測得酶活力達39.3 U/mL。該菌株為耐低溫菌，生長速度快，初始培養(yǎng)和酶反應pH范圍相對較寬。由于水解酶與厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣有密切關(guān)系[10]，經(jīng)過初步應用也證實其效果。因此該菌在提高厭氧水解效率，尤其在偏低溫和常溫條件下處理含蛋白質(zhì)類物質(zhì)較多的污水有廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1] 徐國英，林學政，王能飛，等.極地適冷菌Pseudoalteromonas sp. QI-1產(chǎn)適冷蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].生物加工過程，2011， 9（2）：5-11.

[2] BAGHEL V S，TRIPATHI R D，RAMTEKE P W，et al. Psychrotrophic proteolytic bacteria from cold environment of Gangotri glacier， Western Himalaya，India[J]. Enzyme and Microbial Technology，2005，36（5/6）：654-659.

[3] CHEVALIER P. Nitrogen and phosphorus removal by high latitude matforming cyanobacteria for potential use in tertiary wastewater treatment[J]. Appl Phycology，2000，12（2）：105-113.

[4] RADEMACHER H， ZOBEL T， PASCIK I， et al. Enzyme-supported digestion of municipal sludges at the waste water treatment plant Aachen-Soers[A]. MATA-ALVAREZ J， TILCHE A， CECCHI F. Proceedings of the Second International Symposium on Anaerobic Digestion of Solid Wastes[C].London： IWA Publishing，1999.356-360.

[5] SCHEIDAT B， KASCHE V， SEKOULOV I. Primary sludge hydrolysis under addition of hydrolytic enzymes [A]. MATA-ALVAREZ J， TILCHE A， CECCHI F. Proceedings of the Second International Symposium on Anaerobic Digestion of Solid Wastes[C].London： IWA Publishing， 1999.161-168.

[6] ROMANO R T， ZHANG R H， TETER S， et al. The effect of enzyme addition on anaerobic digestion of Jose Tall Wheat Grass[J]. Bioresource Technology，2009，100：4564-4571.

[7] ZB X 66030-1987，釀造醬油原料、半成品、副產(chǎn)品檢驗方法 蛋白酶活力測定法[S].

[8] 東秀株，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[9] 李 欣，張麗萍，程輝彩，等.耐低溫兼性厭氧淀粉酶產(chǎn)生菌Y89的篩選及酶學特性[J].中國農(nóng)學通報，2011，27（7）：107-111.

[10] 于宏偉，栗志丹，郝珊珊，等.蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學性質(zhì)研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學刊，2006（10）：67-70.

[11] 楊勝遠，陸兆新. 微生物低溫堿性蛋白酶的研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（4）：93-98.

[12] 全桂靜，尹黎獻. 低溫堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株的選育與發(fā)酵條件研究[J]. 沈陽化工大學學報，2011，25（2）：117-120.

[13] 張無敵，宋洪川，尹 芳，等.牛糞在沼氣發(fā)酵過程中的水解酶酶活變化研究[J].能源工程，2003（6）：21-23.