豬源嗜性衣原體HB1043株主要外膜蛋白（MOMP）基因的分析及重組表達

摘要：根據GenBank中衣原體主要外膜蛋白（MOMP）全基因序列設計特異性引物，以臨床分離的衣原體病原中提取的衣原體全基因組為模板，利用特異性引物PCR擴增得到MOMP全基因序列。通過BLAST比對，結果顯示其與已提交的豬流產衣原體CG1株的MOMP序列（EU531729）有1個堿基不同。根據對測序結果進行信號肽序列預測及內切酶位點分析，選用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切將目的蛋白序列克隆到表達載體pET-28a上，得到重組質粒pET-28a-MOMP。將重組質粒轉化入E. coli BL21進行表達，表達產物使用鎳離子親和層析柱進行純化得到目的蛋白rMOMP。目的蛋白經Western-blot檢測，證明其具有免疫學活性。

關鍵詞：豬流產嗜性衣原體；主要外膜蛋白（MOMP）；重組表達

中圖分類號：S852.67 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）04-0949-04

Cloning and Expression of Major Outer Membrane Protein of Chlamydophila Clinical Strain HB1043 from Swine

YAN Shao-xia1，2，TIAN Yong-xiang1，LIU Ze-wen1，YUAN Fang-yan1，GUO Rui1，DUAN Zheng-ying1，

YANG Ke-li1，MENG li1，ZHOU Dan-na1，LI Shao-wen2

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China； 2. College of Animal Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，China）

Abstract： Chlamydophila was an obligate intracecullar parasites and could infect human and multiple animals. According to the published complete nucleotide sequence of Chlamydophila major outer membrane protein （MOMP） in the GenBank and the whole genome of Chlamydophila isolated from clinical samples， the whole genome sequence of MOMP gene were obtained by PCR. The PCR product was sequenced and blasted with the committed MOMP sequence （EU531729） from strain CG1 of swine Chiamydophila abortus. The results showed that it had one base different from the CG1 strain. The extinction enzymes sites BamHⅠand SalⅠwere selected for cloning the MOMP sequence to the pET-28a. The restructuring plasmid pET-28α-MOMP were then transfered into E. coli BL21 and expressed. The target protein rMOMP was purified by the Ni Sepharose 6 Fast Flow and proved with immunocompetence by Western-blot.

Key words： Chlamydophila； major outer membrane protein； recombined expression

衣原體是一類細胞內專性寄生的、大小介于細菌和病毒之間的革蘭氏陰性微生物。衣原體感染在世界范圍內均有流行，是一種能夠引起人和動物患病的人畜共患病原體。依據衣原體核糖體rRNA的序列比對以及多態性限制性酶切位點的分析，將衣原體科分為衣原體屬和嗜性衣原體屬。

嗜性衣原體屬包含鸚鵡熱嗜性衣原體、流產嗜性衣原體、肺炎嗜性衣原體、家畜嗜性衣原體、貓嗜性衣原體以及豚鼠嗜性衣原體[1]。其中，危害最大的病原體主要是流產嗜性衣原體和鸚鵡熱嗜性衣原體。流產嗜性衣原體是從鸚鵡熱嗜性衣原體中衍生出來的一個新成員，這兩種病原體都可以感染豬、綿羊、山羊、牛等哺乳動物，同時作為一種人畜共患的病原體，經常與感染動物接觸的人可經呼吸道傳播的途徑發生感染。人類感染后主要表現為類似流感的病癥，嚴重時可引起心內膜炎、腦炎、肺炎、流產甚至死亡[2]。

近些年來，研究者對衣原體的基因組學以及蛋白質組學進行了深入的研究，但是針對衣原體病的診斷目前尚沒有十分成功的試劑盒得以推廣應用。根據以往的研究報道，作為研究熱點的診斷抗原蛋白有主要外膜蛋白（MOMP）、多型性外膜蛋白（POMPs）、熱休克蛋白（HSP）以及脂多糖（LPS）等。其中40 ku的衣原體MOMP占衣原體外膜蛋白的60%以上，具有血清型、亞種、種和屬特異性抗原決定簇，是衣原體病診斷的主要研究抗原[3]。有研究者對流產嗜性衣原體的CP/12株的MOMP、E型沙眼衣原體的MOMP以及雞源鸚鵡熱衣原體的MOMP全長基因進行了克隆表達[4-6]。

本試驗所用的病原為臨床分離病原，是經特異性引物進行PCR鑒定后的衣原體。經雞胚攻毒試驗證明其具有很強的致死性，致死的雞胚病理變化與以往研究報道相符。同時，實驗室對該病原體的16 S/23 S/16-23 S rRNA進行擴增并經分析鑒定其屬于嗜性衣原體屬。在系統進化樹中，其與鸚鵡熱嗜性衣原體和流產嗜性衣原體親緣關系較近，共用一個節點，但不與鸚鵡熱嗜性衣原體和流產嗜性衣原體共枝[7]。鑒于該株嗜性衣原體具有很強的致病致死性，本試驗對其主要外膜蛋白進行選擇性原核表達，并驗證其免疫學活性，以期為下一步開發豬的衣原體病診斷試劑盒打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬源衣原體HB1043株表達載體pET-28a、感受態細胞Escherichia coli DH5α、E. coli BL21由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所獸醫室保存；限制性內切酶BamHⅠ和SalⅠ、T4 DNA連接酶、DNA Marker以及PCR反應試劑等均購自寶生物工程（大連）有限公司；HRP標記的羊抗豬購自SoutherBiotech；豬衣原體陽性血清為本室衣原體IHA試劑盒（購自湖北省畜牧獸醫局）檢測呈陽性的豬血清；AxyPrep凝膠回收試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank中MOMP全基因序列設計特異性引物上游P1：TTAGGATCCATGAA

AAAACTCTTGAAATCG，前加酶切位點BamHⅠ；下游P2：GCGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAGC，前加酶切位點SalⅠ。引物由生工生物工程（上海）技術服務有限公司合成。

1.2.2 目的基因擴增 使用Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒（Bioer Technology co. Ltd，BSC12S1）提取衣原體基因組。取適量臨床分離株接毒致死的雞胚卵黃囊液于1.5 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液，再15 000 r/min離心30 min，棄上清液，按照試劑盒操作步驟提取基因組。以提取的衣原體全基因組DNA為模板，特異性的引物P1、P2為引物進行PCR反應，反應程序為94 ℃預變性2 min；94 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。采用AxyPrep凝膠回收試劑盒（杭州愛思進生物技術有限公司，AP-GX-50）對PCR產物進行回收，測序。

1.2.3 MOMP基因序列及蛋白特性分析 使用DNAStar、SignalP 3.0 Server等軟件對測序結果進行分析，并與GenBank中衣原體的MOMP序列進行同源性分析。

1.2.4 構建重組質粒pET-28a-MOMP 根據分析結果，選用BamHⅠ和SalⅠ對PCR產物及質粒pET-28a進行雙酶切。經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，采用DNA Fragment Purification Kit ver.2.0（寶生物工程（大連）有限公司，DV807A）對酶切產物進行回收。

將帶有黏性末端的酶切產物使用T4 DNA連接酶反應體系連接。連接產物轉化感受態細胞E.coli DH5α，轉化方法按常規轉化步驟進行。篩選出陽性克隆后小量搖菌，使用E.Z.N.A.Plasmid Midi Kit Ⅰ（Omega Bio-Tek，D6944-01）試劑盒提取質粒。提取的質粒經PCR及酶切鑒定，以確定目的片段正確克隆入載體，重組載體命名為pET-28a-MOMP。

1.2.5 重組質粒的轉化 上一步中構建好的重組質粒pET-28a-MOMP轉化表達載體E. coli BL21。按常規轉化方法進行。

1.2.6 誘導表達 將上一步中轉化成功的表達菌E. coli BL21接種LB培養基進行誘導表達，同時設置對照組：含空質粒pET-28a的E. coli BL21組。具體操作見文獻[8]。

采用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，AR0138）檢測蛋白質表達情況。誘導表達過程中所取的樣品均按照常規方法處理。按試劑盒使用說明配膠，上樣各20 μL，同時加Protein Marker。80 V，40 min后120 V至電泳完成。電泳完畢后進行考馬斯亮藍染色，觀察蛋白表達情況。

1.2.7 rMOMP純化 重新誘導表達重組蛋白rMOMP。具體操作見文獻[8]。

使用Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析柱除去雜蛋白。具體步驟按使用說明書進行。最后洗脫時采用咪唑濃度梯度洗脫，咪唑濃度分別為100、200、300 mmol/L的洗脫液洗脫目的蛋白；洗脫完成后加復性劑使重組蛋白復性；最后使用蔗糖濃縮蛋白液濃縮；收集蛋白，1.5 mL離心管分裝，-70 ℃保存。其中每個步驟取樣待檢。

SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達及純化情況，拍照。

1.2.8 rMOMP活性檢測 重新誘導表達，SDS-PAGE電泳結束后切膠進行Western-blot檢測其免疫學活性，同時做陰性對照，具體操作見文獻[8]。其中陽性組和陰性組所用一抗為經IHA試劑盒檢測確定的陽性血清及陰性血清。觀察結果并拍照。

2 結果與分析

2.1 測序結果及分析

使用DNAStar對MOMP測序結果分析顯示，擴增得到的MOMP序列全長為1 176 bp，編碼的蛋白質為391個氨基酸，分子質量約為42.4 ku。由Protean軟件分析其表面抗原位點如圖1所示。從圖中可看出第20-90位氨基酸殘基之間的區段雖然抗原性位點較強但是其可能不是表面抗原位點，而在100位、240位以及345位氨基酸殘基處抗原性較強，而且均可能為表面抗原位點。

測序結果經BLAST比對顯示，擴增的MOMP與GenBank中流產嗜性衣原體CG1株的MOMP全序列（EU531729）有1個堿基不同，而且此位點突變后CG1株中原有的限制性內切酶位點MsⅡ消失；與鸚鵡熱嗜性衣原體C1/97株以及GD株有3個堿基位點不同。

SignalP 3.0 Server分析結果如圖2，全部391個氨基酸殘基中最有可能為信號肽的是前22個氨基酸殘基。

對序列進行限制性酶切位點分析，在271 bp處為限制性內切酶BamHⅠ位點，而且經此酶切位點切割后后續堿基序列的讀碼框并未受到影響。結合前面的分析結果，將此限制性內切酶位點前的序列切除，對后面部分進行選擇性表達。

2.2 PCR產物電泳結果

以提取的衣原體全基因組為模板，特異性引物P1、P2為引物PCR擴增目的蛋白MOMP的全基因片段，其產物進行瓊脂糖凝膠電泳如圖3所示。從圖中可以清晰地找到目的條帶，大小在1 200 bp左右，與預期大小相符，說明PCR得到了MOMP的全基因片段。

2.3 SDS-PAGE檢測結果

蛋白純化過程中收集的各階段樣品進行SDS-PAGE電泳檢測結果如圖4。由圖4可知，含有空載體pET-28a的BL21組在誘導前后的蛋白表達情況基本上沒有不同，只是蛋白量的多少不同；而含有pET-28a-MOMP重組載體的BL21組在經加入誘導劑IPTG后在42.4 ku大小處可以明顯觀察到有新的蛋白產生，其大小與目的蛋白rMOMP的預測大小一致，說明目的蛋白得到很好的表達；菌體經超聲破碎后的上清中沒有目的蛋白，說明目的蛋白是以包涵體沉淀的形式存在的；3個不同咪唑濃度的洗脫液電泳結果說明咪唑濃度在100 mmol/L時為最佳的洗脫條件；濃縮后的蛋白樣品電泳結果說明經過純化，蛋白溶液中的雜蛋白基本上被除去。

2.4 rMOMP活性檢測結果

對純化得到的rMOMP進行Western-blot試驗，結果如圖5。由圖5可知，rMOMP與豬衣原體的陽性血清發生了反應，而與陰性血清不反應，說明得到的蛋白具有免疫學活性。

3 小結與討論

衣原體的外膜結構與其他革蘭氏陰性菌不同，其缺乏肽聚糖成分，由脂多糖代替。整個分子的穩定性由40 ku的主要外膜蛋白（MOMP）、富含半胱氨酸的60 ku的大蛋白和12 ku的小蛋白通過廣泛的二硫鍵結合形成網絡狀來維持。分子生物學研究表明MOMP是一種膜孔類蛋白，其結構類似于大腸桿菌的OmpF和PhoE通過疏水性和靜電力結合形成的三聚體。MOMP的這個三聚體結構是由3個MOMP單體構成，在單體內部及單體之間存在廣泛的二硫鍵[9]。Rodriguez-Maranon構建的MOMP分子模型中，MOMP單體是由16個反向平行的β-卷曲形成的圓桶狀的分子通道結構。MOMP的4個VD區則位于桶狀結構的外表面，與EB的黏附及進入真核細胞有直接的關系[10]。許多研究資料均表明，MOMP具有很強的抗原活性而且是制備衣原體疫苗最佳的候選單位[11，12]。

信號肽在蛋白外源表達過程中對蛋白的產率、降解以及產物加工復性等都有很大的影響[13]。該試驗對臨床分離的衣原體MOMP全基因片段進行了擴增、測序以及序列分析。分析結果顯示，此株衣原體與已報道的CG1株流產嗜性衣原體的MOMP序列有一個堿基突變，而該位點突變后，CG1株中原有的限制性內切酶位點MsⅡ消失，關于該酶切位點的有無對MOMP性質的影響有待進一步研究分析。同時根據序列分析結果將限制性內切酶位點BamHⅠ之前部分序列切除后進行了誘導表達。表達產物經純化后通過Western Blot檢測其免疫學活性，結果證明試驗中所得到的蛋白仍然具有免疫學活性。關于該株衣原體的MOMP可否作為診斷抗原并進一步開發豬衣原體病的檢測試劑盒等問題將在后續試驗中加以論證。同時該試驗結果也為衣原體基因工程疫苗的研究提供了理論參考。

參考文獻：

[1] EVERETT K D，ANDERSEN A A. Identification of nine species of the chlamydiaceae using PCR-RFLP[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1999，49（2）：803-813.

[2] RODOLAKIS A， MOHARMAD Y K. Zoonotic potential of chlamydophila[J]. Veterinary Microbiology，2010，140（3-4）：382-391.

[3] 邱昌慶. 衣原體基因組學與蛋白組學研究進展[J]. 基礎醫學與臨床，2007，27（1）：94-99.

[4] 栗紹文.豬流產嗜性衣原體抗體EUSA檢測與基因免疫研究[D].武漢：華中農業大學，2008.

[5] 呂 慧. E型沙眼衣原體MOMP基因重組腺病毒及其轉染樹突狀細胞的免疫效果研究[D]. 濟南：山東大學，2007.

[6] 周繼章. 禽源鸚鵡熱衣原體主要外膜蛋白（MOMP）基因重組腺病毒載體的構建與鑒定[J].中國獸醫科學，2006，36（1）13-17.

[7] 周丹娜，閆少俠，劉澤文，等. 豬源衣原體HB1043株分子鑒定及進化分析[A].閻漢文.中國畜牧獸醫學會2011學術年會論文集[C].成都：中國畜牧獸醫學會，2011.410.

[8] SAMBROOK J F，RUSSELL D W. Molecular cloning：A Laboratory manual[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001.1968-1987.

[9] SUN G， PAL S， SARCON A K， et al. Structural and functional analyses of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis[J]. Journal of Bacteriology，2007，189（17）：6222-6235.

[10] GROMIHA M M，AHMAD S，SUWA M. Neural network-based prediction of transmembrane β-strand segments in outer membrane proteins[J]. Computational Chemistry，2004，25（5）：762-767.

[11] BATTEIGER B E， NEWHALL W J， TERHO P， et al. Antigenic analysis of the major outer membrane protein of Chlamydia trachomatis with murine monoclonal antibodies[J]. Infection and Immunity，1986，53（3）：530-533.

[12] FARRIS C M，MORRISON S G，MORRISON R P. CD4+ T cells and antibody are required for optimal major outer membrane protein vaccine-induced immunity to Chlamydia muridarum genital infection[J]. Infection and Immunity，2010，78（10）：4374-4383.

[13] 鄭 斌，詹希美.信號肽序列及其在蛋白質表達中的應用[J].生物技術通訊，2005，16（3）：296-298.