海金沙內生真菌多樣性的研究

摘要：試驗從海金沙的根、莖、葉器官中分離獲得了內生真菌17株，鑒定出16株，另外1株因不產孢子而未被鑒定出，分別屬于3個綱4個目5個科8個屬。在鑒定的8屬內生真菌中，以青霉屬為優勢屬，占總株數的23.5%，其次是頂枝孢屬和鏈格孢屬，各占總株數的17.6%。表明海金沙不同部位、不同季節內生真菌的數量、分布、種群及其組成存在差異，體現了內生真菌生態分布的多樣性。

關鍵詞：海金沙；內生真菌；多樣性

中圖分類號：Q949.36+7.2；Q948.12+2.3；Q346+.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）04-0865-03

Study on the Diversity of Endophytic Fungi of Lygodium japonicum

GAN Jin-lian，PENG Qin，ZHAN Shou-fa，FAN You-fu，CHEN Ye

（College of Life Science， Jiujiang University， Jiujiang 332000，Jiangxi，China）

Abstract： 17 strains of endophytic fungi were firstly isolated from root， stem and leaf tissues of Lygodium japonicum （Thunb.） Sw.， of which 16 strains were identified belonging to 8 genera， 5 families， 4 orders， 3 classes； and one strain had not been identified owing to lack of spores. Among the 8 genera of identified endophytic fungi， Penicillium Link ex Fr. was the dominant genera， accounting for 23.5% of the total number； the second were Acremonium Link and Alternaria Nees ex Fr.， each of which was comprised 17.6% of the total number. Quantity， distribution， and population constitution of endophytic fungi in L. japonicum varied in different tissues of the plants collected in different seasons， which reflected the ecological diversity of endophytic fungi in L. japonicum.

Key words： Lygodium japonicum （Thunb.） Sw.； endophytic fungi； diversity

植物內生真菌（Endophytic fungi）是指那些經過長期協同進化，其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物組織內，而且不會引起宿主產生可見病癥的真菌。植物內生真菌與宿主植物在長期的生態系統演化過程中形成了互惠共生關系，內生真菌能產生與宿主相同或相似的生物活性物質，既具有促進植物生長、增強抗病能力、提高抗逆性等作用，又具有醫學上抗腫瘤、抗微生物等對人類有利的生物功效，因而在人們的生產與生活中具有重要的應用價值。

海金沙[Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.]系海金沙科（Lygodiaceae）海金沙屬（Lygodium Sw.）多年生蕨類植物，主產于廣東、江蘇、浙江、湖南、湖北、四川、陜西、甘肅等省[1]。海金沙多生于陰濕山坡灌叢中或路邊林緣旁，以全草或者干燥成熟的孢子入藥，味甘淡，性寒，有清熱解毒、通淋止痛、利膽消腫的功效，為治療泌尿系統感染、尿路結石、腎炎水腫、感冒發熱、腸炎，痢疾、癌癥等疾病的常用中草藥[2-5]。海金沙的化學成分主要有海金沙素、反式-對-香豆酸、咖啡酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸、十六碳烯酸，亦含脂肪油、氨基酸、黃酮、多糖等物質[6-13]，因此海金沙植物資源的開發利用備受關注。但目前有關海金沙內生真菌的研究鮮見，而且由于對海金沙自然資源的不合理開發所造成的資源匱乏和環境破壞已成為亟待解決的問題。試驗通過對海金沙內生真菌多樣性的研究，旨在尋找替代海金沙的新藥源，為采用微生物發酵技術生產具有抗腫瘤活性的有效成分物質提供理論依據，以減少對自然資源的直接利用，并為藥用蕨類植物資源的野生保護和合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

分離內生真菌所用的植物材料為鳳尾蕨海金沙植株的根、莖和葉，采自江西省九江市南湖公園。分離培養基為WA-抗生素培養基：瓊脂20 g、氨芐青霉素200 mg、鏈霉素200 mg、去離子水1 000 mL；純化培養基為改良的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、10% 海金沙葉水浸提液100 mL加去離子水定容至

1 000 mL，自然pH（使用前在培養基中加80 U/mL慶大霉素1 mL）；促孢培養基：KH2PO4 1.0 g、KNO3 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、淀粉0.2 g、葡萄糖0.2 g、蔗糖0.2 g、瓊脂20.0 g、去離子水1 000 mL，自然pH。

1.2 海金沙內生真菌的分離鑒定

1.2.1 內生真菌的分離培養 取新鮮的海金沙根、莖和葉，用自來水反復沖洗干凈，在超凈工作臺上切成1 cm長的小段，然后進行表面消毒，具體操作流程是：無菌水→0.01%升汞（5 s）→無菌水→無菌水→70%乙醇（5 s）→無菌水→無菌水→無菌水，然后用無菌解剖刀剝取各器官的韌皮部，切成0.5 cm×0.5 cm大小的小片段。用無菌鑷子將已經消毒的植物體放在PDA平板上（平板在使用前要加慶大霉素，用量同前，并均勻推平），然后置于25 ℃恒溫培養箱中培養，3～5 d后即可看見從植物體周圍長出的菌絲。為了檢查表面消毒是否徹底，另外做對照處理；將上述同樣條件下處理過的材料不作切割直接種植于PDA平板上，置于相同的條件下培養，以樣品周圍是否有菌絲生長來判斷分離菌是否能確定為內生真菌。

1.2.2 內生真菌的分離與純化 觀察從植物體上長出的菌落，挑取不同的菌落在新的平板上培養，反復多次直至得到純種菌落，然后轉入PDA斜面培養基上（試管），再在28 ℃條件下純化培養，4 ℃冰箱里保藏備用。

1.2.3 內生真菌的鑒定 觀察純化好的單菌落真菌，記錄其編號及來源并拍照。從純化培養數日的菌落上挑取菌絲并連同分生孢子制成裝片，置于光學顯微鏡下觀察真菌特征（菌絲、有性或無性孢子、孢子的著生狀態等形態特征）。查閱有關真菌分類文獻資料[14-16]，確認所分離獲得的內生真菌的分類地位。

2 結果與分析

2.1 海金沙內生真菌種群多樣性

從海金沙的根、莖、葉組織中共分離獲得內生真菌17株，鑒定出16株，另外1株因不產孢而未被鑒定出，分別屬于3個綱4個目5個科8個屬。在鑒定的8屬內生真菌中，以青霉屬（Penicillium Link，Fr.）為優勢屬，占總株數的23.5%，其次是頂枝孢屬（Acremonium Link）和鏈格孢屬（Alternaria Nees ex Fr.），各占總株數的17.6%。這些真菌多數屬于半知菌綱，少數屬于子囊菌綱和核菌綱，表明海金沙內生真菌的分布存在生態分布的種群多樣性，具體見表1。

2.2 不同季節對海金沙內生真菌分布的影響

由于季節更替，造成外在環境因素與海金沙體內微生態環境發生變化，使得植物的內生真菌生長條件也隨之發生改變，因而導致培養出來的菌株出現一定的差異。具體情況見表2。從表2可以看出，春夏季節培養出來的菌株數量要比秋冬季節的多。由于九江地區夏季比較潮濕，而海金沙正是在潮濕的環境下生長發育比較好，并且這種潮濕環境比較適合內生真菌的生長，其中主要是以青霉屬、枝孢霉屬為優勢屬；而秋冬季的濕度與溫度都比春夏季低，對內生真菌的生長有所抑制，所以相比較春夏季節真菌的數量較少，但其中的優勢屬仍是青霉屬，另一個優勢屬是頂枝孢屬。這個結果說明海金沙內生真菌的分布存在季節差異，其內生真菌的生態分布與季節有關。

2.3 不同植物器官對海金沙內生真菌分布的影響

海金沙的根、莖、葉等不同器官上發生的內生真菌在種群分布和優勢種群以及各種屬出現頻率的差異比較結果見表3。從表3可見，海金沙不同器官分離出的內生真菌頻率高低順序為莖、根、葉，表明植株各器官韌皮部所占比例大的部位內生真菌數量較多，而木質部所占比例大的部位次之，從葉脈里分離獲得的內生真菌數量最少，說明內生真菌在海金沙不同器官上的分布是不同的。

3 討論

海金沙根、莖、葉等不同器官上的內生真菌在數量、種群分布和優勢種群方面都存在較大的差異，說明海金沙內生真菌存在數量和種群多樣性的特點。同種植物不同部位內生真菌種類產生差異的原因可能是由于不同部位的微環境如通氣狀況、酶構成和其他化學成分存在差異造成的，因而適合不同內生真菌類群的侵入和定殖。

從植物中尋找抗菌、抗腫瘤的天然活性物質是長期以來新型藥物研究的重要內容和可行途徑，現在人類已成功地從紅豆杉屬（Taxus L.）植物中分離出了內生真菌，并將之開發為生產抗癌新藥的生物來源[17]；目前已報道的植物內生真菌的次生代謝產物涉及到抗菌、殺蟲、促進植物生長等多個方面[18]。在海金沙植物內生真菌中，某些屬種真菌具有潛在的應用價值，如自然界的廣布類群青霉屬等。而關于海金沙其他內生真菌的潛在應用價值，還有待進一步研究。

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