大孔吸附樹脂法提取HK-1菌株抗菌物質

張其安 申麗霞 盧德梅 楊少波

（1. 山東華康蜂業有限公司，日照 276500；2. 山東莒縣人民醫院，日照 276826）

1994年，Ash等（1994）在分子生物學研究結果的基礎上將11個種從芽孢桿菌屬中分離出來另立類芽孢桿菌屬，并將多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）立為類芽孢桿菌屬的模式菌種[1]。大量的研究表明，類芽孢桿菌屬的某些細菌具有顯著的生防潛力，同時類芽孢桿菌還具有生長快、營養簡單、可生成具抗逆能力的芽孢等特點[2]。近幾年來，國內外有關類芽孢桿菌應用與動植物疾病生物防治的報道日益增多。

歐洲幼蟲腐臭病簡稱歐幼病，是蜜蜂幼蟲的一種細菌性消化道傳染病，在世界各地均有發生，具有傳播迅速、發病快的特點，中蜂（Apis cerana Cerana Fabricius）比意蜂（Apis mellifera ligustica Spinola）更容易受感染[3]。歐洲幼蟲腐臭病是由多種致病菌共同作用而引起的，但其主要病原是蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton）[4]。蜂房蜜蜂球菌是一種革蘭氏陽性菌，但有染色特性不穩定，有時候可能為革蘭氏陰性菌，兼性厭氧[5-6]。蜂房蜜蜂球菌抵御不良環境的能力極強，能在蜂尸上存活數年，在粉蜜里也能保持長久的毒性，所以歐洲幼蟲腐臭病是一種傳染性極強的蜜蜂傳染病。蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病的防治方面的研究始于20世紀初，早期主要是以施用四環素、磺胺類抗生素為主[7]。隨著人們對無公害和綠色食品要求的與日俱增，蜂產品中多種抗生素殘留的檢測已經成為許多國家蜂產品質量檢測的必檢項目，美國、歐盟、日本等國家已禁止含有多種抗生素殘留的蜂產品進入本國，這對我國蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病的防治工作又提出了新的要求[8]。Paenibacillus brasilensis HK-1由本實驗室從蜂場土壤中分離獲得，該菌株對蜂房蜜蜂球菌、蜂房哈夫尼菌、幼蟲芽孢桿菌、蜜蜂球囊菌等常見的蜜蜂細菌病病原物具有較強的拮抗作用，且發酵性狀優良[9]。本試驗研究了大孔吸附樹脂對Paenibacillus brasilensis HK-1菌株抗菌物質的提取，為該菌株及其抗菌物質在蜜蜂細菌疾病防治方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

拮抗菌：Paenibacillus brasilensis HK-1由本實驗室分離鑒定

抗菌物質效價指示菌：蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluton）由本實驗室保存。

1.1.2 大孔吸附樹脂

AB-8、X-5、D3520、D4020、H103、Nka-9由南開大學提供。

1.1.3 培養基

菌株活化培養基：土豆 200g，牛肉膏 5.0g，葡萄糖 20g，瓊脂 15g，（NH4）2SO41.0g，MgSO41.0g，KH2PO40.6g， CaCO33.0g，蒸餾水1000mL。

菌株發酵培養基：土豆 200g，牛肉膏 5.0g，葡萄糖 20g，（NH4）2SO41.0g，MgSO41.0g，KH2PO40.6g，CaCO33.0g，蒸餾水 1000mL。

發酵液效價生物測定培養基：底層培養基：瓊脂 18 g，蒸餾水1000mL；上層培養基：NaCl 10g，蛋白胨 10g，酵母浸膏 5g，瓊脂 15g，蒸餾水1000mL，pH 6.8。

1.2 方法

1.2.1 抗菌物質效價的測定

生物檢測平板的制備：采用雙層平板法。底層：在直徑為90mm的無菌平皿中加入15mL融化的發酵液效價生物測定培養基。上層：取滅菌冷卻到50℃~55℃的上層培養基，加入3%的蜂房蜜蜂球菌菌懸液，按照10mL/皿加入培養皿中；冷凝后備用。

效價測定：采用牛津杯法[10]。在每個平板上以等距離均勻放置牛津杯（內徑6mm±0.1mm，高10mm±0.1mm，外徑8mm±0.1mm）4個。向每個杯中準確加入250μL不同濃度的抗菌物質溶液，每個濃度設3個重復。37℃培養18 h后用游標卡尺測量抑菌圈直徑。

1.2.2 抗菌物質的發酵

發酵培養基經121℃高壓滅菌20min，以2%的接種量將種子液接種到250mL三角瓶中。200r/min，28℃震蕩培養48h。發酵液100℃滅菌10min，4200r/min離心30min，取上清液備用。

1.3 大孔吸附樹脂提取HK-1菌株產生的抗菌物質

1.3.1 大孔吸附樹脂吸附性能比較

取1.1.2節中處理好的大孔吸附樹脂1g/份，分別加入1.2.2節中HK-1菌株發酵液上清液10mL，150r/min震蕩吸附4h，測定發酵液原液、吸附殘液效價，計算大孔吸附樹脂對HK-1菌株抗細菌物質的吸附率。每個處理2個重復。

1.3.2 大孔吸附樹脂解吸性能比較

取1.3.1節中篩選出的吸附性能優良的大孔吸附樹脂1g/份，分別加入1.2.2節中HK-1菌株發酵液上清液10mL，150r/min振蕩吸附4h。然后分別用50%、75%的乙醇、甲醇和丙酮解吸劑，150r/min振蕩靜態解吸4h。測定發酵原液、解吸液、吸附殘液的效價，計算解吸率，比較各種大孔吸附樹脂的解吸性能。每個處理設置2個重復。

1.3.3 丙酮濃度對解吸效果的影響

以體積分數為25%、50%、75%、90%的丙酮溶液為解吸劑，分別對吸附后的樹脂靜態解吸。測定發酵原液、解吸液、吸附殘液的效價，計算解吸率，比較不同濃度丙酮溶液的解吸效果。每個處理設置2個重復。

1.3.4 X-5樹脂飽和吸附量的測定

取篩選到的X-5樹脂1g/份，分別加入HK-1抗菌物質粗物（發酵液上清經以上篩選到的最佳吸附樹脂、解吸液吸附、解吸后，解吸液經濃縮、冷凍干燥所得固體粉末為抗菌物質粗物）5g/L的溶液5mL、10mL、20mL、30mL、40mL，150r/min振蕩吸附4h。測定抗菌物質粗物溶液、吸附殘液的效價，計算樹脂的吸附量。每個處理設置2個重復。

1.3.7 90%丙酮溶液動態解吸曲線及動態解吸率的測定

X-5樹脂：提取液1：10（m/V），150r/min振蕩吸附4h。棄去上清液，樹脂用去離子水沖洗3次后裝入直徑16mm，柱長400mm的層析柱，先用3倍柱體積的30%丙酮溶液洗脫。然后用90%的丙酮溶液對進行動態解吸。流速為1mL/min，用自動部分收集器分管收集解吸液，每10min收集一管，每管10mL，測定發酵原液、吸附殘液以及每管解吸液的效價，繪制解吸曲線并計算動態解吸率。

1.4 HK-2菌株抗菌物質的部分理化性質

1.4.1 對熱的穩定性

配制抗菌物質粗物溶液（5g/L），分別于50℃、70℃、100℃水浴中處理10min、20min、40min、60min、80min、100min，牛津杯法測定其效價，比較抗菌物質的效價變化。

1.4.2 抗菌物質對酸堿的穩定性

抗菌物質粗物分別溶于pH為1.2、2.4、3.1、4.9、6.8、10.3和12.4的緩沖液溶液，室溫靜置12h，比較抗菌物質效價變化。

1.4.3 對紫外線的穩定性

抗菌物質粗物水溶液置于紫外燈下40cm，分別輻照2h、4h、6h和8h，比較抗菌物質效價變化。

2 結果與分析

2.1 牛津杯法測定效價工作曲線的建立

以抗細菌活性物質濃度的對數值為橫坐標，以抑菌圈直徑為縱坐標制作的標準曲線如圖1所示。可見，濃度的對數值與抑菌圈直徑呈線性關系，其決定系數R2＝0.9935，可以滿足效價測定的要求。由此，可得到發酵液效價計算方程：Y=10（x+4.0913）/6.0594×n〔Y：發酵液效價（μg/mL）；x：抑菌圈直徑（12.3mm

圖1 牛津杯法測定效價工作曲線

2.2 大孔吸附樹脂吸附性能的比較

各種大孔吸附樹脂對HK-1抗菌物質的吸附效果如圖2所示。可以看出，大孔吸附樹脂X-5、AB-8、Nka-9對抗菌物質吸附率達90%以上，其它幾種樹脂吸附性能較差。選擇X-5、AB-8、Nka-9樹脂繼續考察其解吸性能。

圖2 大孔吸附樹脂吸附性能比較

2.3 大孔吸附樹脂解吸性能比較

分別采用不同有機溶劑作為解吸劑對抗菌物質進行解吸。由圖3可以看出，同一種有機溶劑，濃度高的有機溶劑解吸效果優于濃度低的有機溶劑；不同有機溶劑以75%的丙酮解吸效果最好。4種樹脂以X-5解吸效果最好，其靜態解吸率達68%。因此，選擇X-5為HK-1抗菌物質的最佳吸附樹脂，進一步篩選最佳解吸劑的濃度。

圖3 大孔吸附樹脂解吸性能比較

2.4 丙酮濃度對解吸效果的影響

已篩選到的X-5樹脂為抗菌物質的吸附樹脂，考察不同濃度丙酮對抗菌物質的解吸效果。結果如圖4所示，丙酮濃度在40%～80%范圍內解吸率逐漸升高，80%的丙酮解吸率最高，解吸率為73%。

圖4 丙酮濃度對解吸率的影響

2.5 X-5樹脂飽和吸附量的測定

以抗菌物質粗物的質量為橫坐標，吸附率為縱坐標，繪制X-5樹脂的吸附曲線，結果見圖5。可以看出，隨著抗菌物質粗物質量的增加，吸附率逐漸降低，1g樹脂加入6mg抗菌物質粗物時吸附率可達97.5%。試驗選取吸附率為97.5%時樹脂吸附的抗菌物質的質量為吸附量。經測定X-5樹脂的飽和吸附量為5.85mg/g。

圖5 X-5樹脂對抗菌物質的吸附量

2.6 80%丙酮動態解吸曲線

以80%丙酮HK-1抗菌物質進行動態解吸。解吸曲線如圖6所示，解吸液中抗菌物質濃度較為集中，解吸效果較好，經計算各管的解吸率，結果總解析率為95.3%。這一結果說明，試驗篩選的樹脂和解吸劑均比較理想。

3 討論

圖6 X-5樹脂的動態解吸曲線

利用微生物活體防治蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病不僅有對其釋放風險的擔憂，也受釋放技術及環境溫度、濕度等諸多因素的限制，所以研究者更期望從拮抗菌種提取活性物質用于生物防治[11]。樹脂法提取活性物質具有設備簡單、操作方便、生產周期短、能耗和成本低、無需添加輔料等優點，利于工業化擴大生產[12]。本研究采用大孔吸附樹脂X-5提取Paenibacillus brasilensis HK-1菌株發酵產生的抗菌物質，為該抗菌物質的純化及其在蜜蜂歐洲幼蟲腐臭病防治方面的應用提供了理論參考。

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