針刺及川芎嗪對急性藥物性聾豚鼠耳蝸內氧自由基生成影響實驗研究

韓明訓 趙烏蘭 王一鳴 王永華 沈曉麗 浙江中醫藥大學聽力與言語科學學院 杭州 310053

·論 著·

針刺及川芎嗪對急性藥物性聾豚鼠耳蝸內氧自由基生成影響實驗研究

韓明訓 趙烏蘭 王一鳴 王永華 沈曉麗 浙江中醫藥大學聽力與言語科學學院 杭州 310053

目的：探討川芎嗪（TMP）、針刺單獨應用及聯合使用對慶大霉素（GM）致聾豚鼠耳蝸內氧自由基生成的影響。方法：50只健康豚鼠隨機分為正常組、模型組、川芎嗪組、針刺組及TMP+針刺組，每組10只，正常組按2.5mL/（kg·d）劑量腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射慶大霉素100mg/（kg·d），連續14天，TMP組、針刺組、TMP+針刺組同時灌服TMP和（或）針刺相關穴位。造模結束后迅速斷頭處死，取耳蝸標本。正常組與模型組動物于用藥前及停藥后第1天分別測試聽覺腦干誘發電位（ABR）以判斷造模是否成功；硫代巴比妥法檢測血清丙二醛（MDA），黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（SOD）。結果：各治療組與模型組比較MDA表達均明顯減少（P＜0.01），尤以TMP+針刺組改善明顯（P＜0.01）。各治療組SOD活力均有提高，各組間差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：針灸配合TMP明顯提高耳蝸組織內SOD活力，防止脂質過氧化，對急性耳毒性藥物早期損傷具有一定的防治作用。

豚鼠 藥物性聾 川芎嗪 針刺 氧自由基

自由基作為機體新陳代謝的正常副產物，體內所有細胞均可產生，并且可被各種防御體系滅活，使之維持在正常水平。但是某些病理因素能導致自由基生成過多，從而對機體造成損傷[1]。川芎嗪（TMP）是中藥川芎的有效成分，能降低慶大霉素（GM）對內耳毛細胞的毒性損害[2]；而針刺臟腑組織器官所關聯的穴位可增強藥物在機體內的靶向效應[3]。本實驗通過觀察針刺和川芎嗪對GM致聾豚鼠耳蝸內氧自由基的影響，探討川芎嗪（TMP）配合針刺對急性藥物性聾豚鼠的防治作用及機制。

1 材料與方法

用U/mL表示，MDA含量用μmol/L表示。

1.6 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件對各組數據進行統計分析，多組間均數比較用方差分析。實驗數據以均數±標準差（±s）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

1.1 動物選擇及實驗分組 健康級白色紅目豚鼠50只，體質量240～310g，雌雄各半，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK（浙）2005-0021。所有動物Preyer反射正常，無耳疾。隨機分為正常組、模型組、TMP組、針刺組、針刺+ TMP組，每組10只。

1.2 藥品和試劑 鹽酸川芎嗪：北京市燕京制藥廠，批號：050701；硫酸慶大霉素注射液，每支2mL含GM 80mg，湖北天藥藥業股份有限公司生產，國藥標字H42020030；MDA測定試劑盒，批號：20081105；TSOD測定試劑盒，批號：20081111。

1.3 電針及給藥方法 正常對照組每天按2.5mL/kg劑量腹腔注射生理鹽水，其余各組每天腹腔注射慶大霉素100mg/kg，連續14天；TMP組同時灌服川芎嗪200mg/kg；針刺組同時針刺雙側聽宮、翳風、外關[4]（穴位參照文獻報道的實驗動物解剖學與人體穴位相應部位[5]），連續輸出，刺激強度動物能忍受為度，持續刺激20min；TMP+針刺組先針刺雙側聽宮、翳風、外關（方法同針刺組），針刺后立即灌服川芎嗪，劑量同TMP組；各組動物均連續針刺和（或）用藥14天，每天測量體質量調整用藥劑量，直至造模完成。根據ABR測定確定造模是否成功[2，6]。

1.4 ABR檢測聽反應閾 用藥前及連續用藥14天后的第1天檢測雙耳ABR。動物在戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉后，記錄電極置顱頂正中，參考電極及接地電極分別置于給聲耳及對側耳后乳突部皮下。用ZEP型聲刺激器，采用短聲（click）刺激，掃描時間10ms，疊加512次，帶通濾波100～3 000Hz，在屏蔽隔聲室內常規測試。

1.5 耳蝸組織SOD活力和MDA含量測定 各組豚鼠停藥后第一天測試。ABR后，迅速斷頭處死豚鼠取出聽泡，蝸頂刺穿，在解剖顯微鏡下于0～4℃生理鹽水中剔除蝸殼，將蝸軸連同膜蝸管取下，雙耳合為一份標本放入離心管內。加入10倍體積生理鹽水，用DLAX 900型勻漿機將上述組織研碎制成勻漿。4℃下離心10min（4 000r/min）后，分別取上清液0.1mL，應用黃嘌呤氧化酶法測定和硫代巴比妥酸法測定耳蝸組織中T-SOD活力和MDA含量。SOD活力單位

2 結 果

2.1 ABR檢測聽反應閾 治療后正常組與模型組ABR閾值比較，差異有統計學意義（P＜0.01），顯示造模成功，見表1。

表1 用藥前后豚鼠ABR閾值比較（±s）

注：與用藥前比較，△P＜0.01；與正常組比較，*P＜0.01

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2.2 各組豚鼠血清MDA表達吸光值比較 正常組、各治療組與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），TMP+針刺組與其他組比較，差異有統計學意義（P＜0.01)；正常組與TMP組、針刺組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；針刺組與TMP組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組豚鼠血清MDA表達吸光值（±s）

注：與TMP+針刺組比較，▲P＜0.01；與模型組比較，☆P＜0.01

2.3 各組豚鼠血清SOD表達比較 模型組與正常組、針刺組及TMP+針刺組比較，差異有統計學意義（P＜0.01)；TMP組與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；正常組與各治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；各治療組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組豚鼠血清SOD表達比較（±s）

注：與模型組比較，☆P＜0.01

組別n/只SOD正常組模型組TMP組針刺組TMP+針刺組10 10 10 10 10 131.33±4.06☆121.49±3.02 129.20±8.29 139.53±9.98☆166.57±9.42☆

3 討 論

氨基糖苷類抗生素對聽力損失的病理表現在耳蝸毛細胞破壞，尤其是外毛細胞最易受損。造成其損傷的毒性機制是細胞內線粒體蛋白質合成和氧自由基的形成障礙所致。氨基糖苷類抗生素可以通過激活一氧化氮合酶，增加一氧化氮的濃度，使內耳產生自由基。SODs是體內最主要和最常見的抗氧化系統，對機體氧化和抗平衡起著至關重要的作用，它可歧化超氧陰離子生成H2O2，從而消除其毒性，保護細胞免受損傷。因此，SOD間接反映了體內清除氧自由基的能力；MDA則是過多的氧自由基積累引發脂質過氧化作用形成的脂質過氧化物，它能造成神經細胞的裂變死亡。

Priuska等[7]報道GM可通過與鐵形成GM-鐵復合物而具有氧化還原活性，該復合物在體外和完整細胞內都能催生產生超氧陰離子，進而損傷毛細胞，導致聽力障礙。本實驗中，模型組SOD活性降低，MDA增加，提示GM中毒后，耳蝸內超氧陰離子增多，SOD活性降低，脂質氧化產物MDA增加，這也與陳賢明等[8]研究結論相一致。

川芎嗪是中藥川芎的有效成分，化學結構為四甲基吡嗪（TMP），可通過血液、耳蝸外淋巴液及腦脊液三種途徑直接作用于耳蝸和聽神經。它可通過清除氧自由基及改善內耳血管紋循環，改善聽力。崔城等報道[9]，中藥川芎嗪可以改善慶大霉素中毒導致的感音神經性聾聽覺功能。

本實驗針刺選用聽宮、翳風和外關穴三穴。聽宮為近端取穴是手足少陽、手太陽經的會穴，是治療耳聾的特效穴；翳風是手足少陽之會穴，針刺可起到改善局部血管營養和神經調節的作用。外關穴為手少陽絡穴，又為八脈交會穴《針灸大成》“主耳聾，渾渾淳淳無聞，五指盡痛，不能握物”手足少陽經均“從耳后入耳，出走耳前”，手太陽經脈“卻入耳中”，三穴合用有聰耳開竅之功效，可改善機體新陳代謝，激發細胞活性，從而增強藥物在機體內的靶向效應[10]。

本實驗結果顯示，慶大霉素能引起組織內氧自由基的增多，SOD活性降低，MDA含量升高，各治療組均能不同程度的拮抗慶大霉素的作用。治療后除TMP組，其他各治療組SOD的活性較模型組有明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；各治療組MDA均明顯降低，與模型組比較，差異具有統計學意義（P＜0.01）；針刺配合川芎嗪組效果最佳（P＜0.01）。另外，筆者前期研究發現，針刺加川芎可通過抑制Bax蛋白表達，調節Bcl-2蛋白表達，而達到對耳蝸螺旋神經節細胞凋亡的調控作用[11]。由于Bcl-2蛋白存在線粒體內膜部位，這個部位又因多聚不飽和脂肪酸含量較多易被攻擊而成為活性氧產生的主要場所。因此，Bcl-2具有抗氧化作用并可通過抑制活性氧形成而抑制細胞凋亡。據此我們可以推斷，針刺加川芎對耳毒性保護存在多種相互關聯的內在機制，可能通過增強Bcl-2表達，提高SOD活性，抑制自由基的產生，以對抗藥物對耳神經所造成的損傷。

由此可見，針灸配合川芎嗪可以減少急性藥物性聾豚鼠MDA的表達，增強SOD活性，從而抑制自由基生成，保護耳蝸免受損傷。

［1］王愛梅，湯浩，沈靜，等.丹參注射液對慶大霉素耳中毒豚鼠耳蝸氧自由基生成的影響［J］.中國應用生理雜志，2004，20（4）：406-408.

［2］趙烏蘭，王永華，王楓.針刺及川芎嗪對急性藥物性聾豚鼠耳蝸生長相關蛋白GAP-43表達的影響［J］.浙江中醫藥大學學報，2008，32（6）：793-795.

［3］成澤東，陳以國.針刺對大鼠體內中藥有效成分（TMP）趨向性影響的實驗研究［J］.中國針灸，2002，22（1）：5133.

［4］付平，王順金.針刺治療對藥物性耳聾病理形態學影響的實驗研究［J］.北京針灸骨傷學院學報，1999，6（2）：7-8.

［5］李辭蓉，華興邦，周浩良，等.豚鼠針灸穴位圖譜的研制［J］.上海針灸雜志，1992，21（2）：28-31.

［6］鄭華平，王楓，徐泉珍，等.針刺對川芎嗪防治豚鼠慶大霉素中毒性耳聾靶向作用的影響［J］.中國針灸，2008，28（7）：515-518.

［7］Priuska EM，Schacht J.Formation of free radicals by gentamicin and iron and evidence for an iron/gentamicin complex［J］.Biochem pharmacoi，1995，50：1749-1752.

［8］陳賢明.王錦玲，姜鴻彥,等.水楊酸鈉降低慶大霉索所致耳蝸自由基含量的實驗研究［J］.聽力學及言語疾病雜志，2000，8（2）：68-70.

［9］崔城，湯浩，崔桂英，等.川芎嗪拮抗慶大霉素耳毒性作用的實驗研究［J］.現代康復，2001，5（2）：53-54.

［10］鄭華平，王楓，徐飛，等.針刺對川芎嗪防治豚鼠慶大霉素中毒性耳聾靶向作用的影響［J］.中國針灸，2008，28（7）：515-518.

［11］王永華,劉金洪，王楓，等.針刺及川芎嗪對慶大霉素致耳聾豚鼠螺旋神經節細胞凋亡及調控基因Bcl-2、Bax表達的影響［J］.中國中西醫結合耳鼻喉科雜志，2007，15（5）：321-325.

Effects of Tetramethylpyrazine and Acupuncture on Cochlear Free Radical Expression of Piunea Pigs with AcuteDrug-induced Deafness

HAN Mingxun，ZHAO Wu
lan，WANG Yiming，et al.The Rehabilitation Institute For the Deaf ZJUTCM，Hangzhou(310053)，China

Objective：To investigate the effect of acupuncture and tetramethylpyrazine（TMP）on cochlear free radical expression of mice with acute drug-induced deafness.Methods：Fifty guinea pigs were randomly divided into 5 groups，including normal，model，TMP alone，acupuncture alone，and TMP plus acupuncture groups，10 animals in each group.Each group

different procedures.The normal group was prepared by consecutively intraperitoneal injection with normal saline of 2.5 mL/（kg·d）.Acute drug-induced deafness was made by consecutively in traperitoneal injection with gentamycin（100 mg/kg·d）in other groups.All groups were injected for consecutive 14 days.Before and 1 day after 14-day injection,the mice were tested ABR to identify whether the models were successful.The methods of thiobarbituric acid and xanthine oxidase were used to test serum malondialdehyde（MDA）and superoxide dismutase（T-SOD）.Results：The expression of MDA was reduced in all treatment groups as compared with that of the model group（P＜0.01），with the most reduction seen in the TMP plus acupuncture group.The activity of SOD was enhanced in all treatment group，but with no significant difference among the treatment groups（P＞0.05）.Conclusion：TMP plus acupuncture can effectively increase the activity of SOD and reduce the expression of MDA in the cochlear tissue.They may have effect against gentamycin-induced inner ear diseases.

piunea pigs drug-induced deafness tetramethylpyrazine acupuncture free radical formation

2013-07-02

國家自然基金面上項目（No.81173309）；浙江省中醫藥科技計劃項目（No.2010ZA015）

王永華，Tel：13606626396；E-Mail：wangyh@vip.sina.com