DDRT－PCR技術在中藥研究中的應用

丁常宏，都曉偉，徐瑩

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

真核生物一般約有10萬個基因，而在單個細胞中，僅有約15%的基因可以表達?；虻倪x擇表達，決定著整個生命過程中的發育、分化、應激反應、內環境穩定、細胞周期調控等?；虻倪@種差異表達不僅受生物體內在機制的調控，也受外界環境因素，如光照、溫度、逆境、藥物作用等的影響。如何有效地分離并克隆在不同處理條件下、不同發育階段或不同細胞群體間差異表達的基因，是分子生物學研究的一大熱點。目前，分離克隆差異顯示基因的方法主要有扣除雜交(subtractive hybridiza－tion)、mRNA差別顯示(mRNA differential display reverse transcription，DDRT－PCR)、基因表達系列分析(serial analysisof gene expression，SAGE)、代表性差異分析(representational difference analysis of cDNA，cDNARDA)、抑制性扣除雜交(sup－pression subtractive hybridization)、RFLP與區域定向差異技術偶聯的DDRT－PCR(RFLP－Coupled domaindirected display，RC4D)、cDNA － AFLP、基因芯片等。其中由Liang等發明的DDRT－PCR因為具有簡便、快速、高效、所需RNA量少等優點而被廣泛用于真核生物基因差異表達的研究和差異表達基因的分離克?。?］。這里綜述了該技術的原理，并簡要介紹了其在中藥學研究中的應用。

1 DDRT－PCR技術基本原理

mRNA差異顯示技術(mRNA differential display reverse transcription PCR，DDRT－PCR)是一種比較不同細胞系、不同組織間，或同一細胞系、同一組織不同條件下基因表達差異的技術方法。該技術可分為三個基本步驟。第一步RNA的提取及反轉錄:分別提取兩種或多種材料中的總RNA或mRNA，反轉錄成cDNA。第二步PCR擴增:利用cDNA3'端錨定引物和5'端隨機引物組成引物對，在較低退火溫度下(32～42℃)擴增生成cDNA。第三步分離比較擴增產物:利用高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳，對PCR產物進行分離，由于擴增的cDNA片段被放射性同位素或熒光素標記，通過自顯影或顯色技術，即可獲得差異表達基因擴增的條帶，但大多數情況下，以方便、節約為目的，利用銀染技術顯示差異條帶，在相鄰泳道上比較基因表達的差異［2］。

與傳統的方法相比，DDRT－PCR技術能夠快速地顯示mRNA的組成，可同時對比多個樣本mRNA的差異，擴增的cDNA可以用來測序、亞克隆及用作探針篩選文庫。并且由于PCR擴增技術的運用，可同時獲得高豐度和低豐度表達的基因。當然DDRT－PCR技術也存在假陽性多、特異性cDNA片段短、擴增傾向高豐度mRNA等不足。目前許多學者對DDRT－PCR技術進行了改進:如從引物的長度、組合的數目、堿基的組成方面進行改進;通過優化PCR循環參數來提高DDRT－PCR技術的重復性、明顯降低假陽性率;通過扣除雜交、巢式引物重擴增cDNA片段等方面來降低假陽性;在從聚丙烯酰胺凝膠上切取差異條帶時，選取相互對照組的各組間信號強度對比明顯的條帶，當在切下的一條帶中可能含有幾條cDNA片斷時可用單鏈構象多態性(SSCP)方法區分開來;用反向Northern點雜交檢測陽性克隆可大大減少工作量;也有用Real Time－PCR的方式來鑒定差異片段的方法，去除假陽性的困擾，無論從準確性還是減少工作量方面都有了較多的改進。

2 DDRT－PCR在中藥研究中的應用

DDRT－PCR技術已成為分析基因差異表達、分離和克隆差異表達基因的有力工具。這項技術近年十年來已開始在植物、動物、微生物［3］研究中應用。目前在生物的基因表達［4］、基因的鑒定與克?。?－6］、植物抗性［7］、環境脅迫［8－9］、病理［10］等方面已有成功報道。但在中藥研究中應用的例子還不多，但已顯示出極強的可塑性和應用性。

2.1 中藥作用機制的研究

DDRT－PCR技術可以比較同一種組織或細胞在使用某種中藥或中藥活性成分處理后所引發的基因差異表達，篩選差異表達基因，以此來研究該中藥或其活性成分對細胞行為的影響。DDRT－PCR可以從基因表達的水平入手，研究特定細胞(靶細胞)在mRNA水平上藥物的干預情況，所以可以更全面揭示藥物的作用機制，更好地闡明中藥的多環節、多靶點的作用方式。

苦參堿可用于人白血病的治療，何於娟等［11］應用改良的DDRT－PCR技術研究苦參堿誘導人紅白血病K562細胞分化的分子機制，得出苦參堿能誘導K562細胞基因表達譜發生變化，而且此過程是一個多基因參與的過程。郝崗平等［12］用DDRT－PCR方法研究發現丹參注射液處理動脈粥樣硬化大鼠，會使其胸主動脈細胞發生一些基因表達水平發生變化，減弱血管內皮細胞發生的病理變化，從而阻礙動脈粥樣硬化斑塊的形成。王澤平等［13］用泰山赤靈芝多糖注射液處理動脈粥樣硬化大鼠，觀察其血脂的變化，并利用DDRT－PCR技術篩選大鼠胸主動脈細胞用藥前后差異表達的基因，了解到泰山赤靈芝多糖治療動脈粥樣硬化、降低血脂的分子機制。GY Shi等［14］利用DDRT－PCR技術研究了長春瑞濱和多烯紫杉醇作用于人肺癌細胞株時引發的基因表達差異，以探索兩種抗腫瘤藥物的治病機理。

2.2 中藥復方作用機制的研究

中藥復方成分復雜，且各種成分含量極微，它對機體的調控作用是多靶點、多環節的，至今很多中藥復方的作用機制仍不明確。傳統的方法往往從全方或拆方的角度得到一些片面或表面的結論，不能深入發掘中藥復方的作用機制，也很難顧及中藥復方的復雜性和整體性。血清藥物化學、分子生物學等可以對中藥復方進行整體把握的現代手段逐漸被應用并取得了階段性的進展。其中DDRT－PCR技術就可以了解復方對整個細胞基因表達情況的影響，通過各自不同的表達譜，比較研究不同配伍組方對應的基因表達靶點，并可根據表達水平與復方的君、臣、佐、使理論及用藥劑量相關性，闡明藥物作用的物質基礎及其內在配伍規律。

近年來的研究工作主要表現在通過比較復方對細胞基因表達譜的影響，鑒別差異表達的基因，從而尋找復方作用的靶基因并推測中藥復方作用的分子機制及內在規律。柴立民等［15］利用DDRT－PCR技術分析在益髓生血顆粒治療前后，β－珠蛋白生成障礙性貧血患兒骨髓有核細胞的基因表達差異。發現治療3個月后患兒的鐵蛋白基因表達明顯降低，這有效緩解了患兒體內鐵的蓄積，推測可能是益髓生血顆粒治療β－珠蛋白生成障礙性貧血病的分子機制之一。

馬宇漠等［16］利用DDRT－PCR技術研究用健骨沖劑對去勢大鼠處理后，其骨組織中基因的差異表達。共篩選出10條有差異表達的基因片段，其中2條為透明質酸調節的運動受體(RHAMM)和Na+－K+－ATP轉運酶β3亞單位(ATPlb3)的mRNA片段。而且這兩個片段在健骨沖劑作用后表達分別下降和上調。張沖等［17］利用DDRT－PCR技術探索補腎益腦片對快速衰老小鼠的生理及其腦組織基因表達的影響，得到14個差異表達條帶，發現其中的3個條帶的序列分別與脂肪酸結合蛋白－7、還原型輔酶Q－細胞色素c還原酶復合體7.2kD亞單位及核糖體大亞基的第21亞單位的mRNA序列同源。同源性分別達到97%、100%、99%。從而得出補腎益腦片抗衰老功效的發揮可以通過調節小鼠腦組織基因表達水平來實現。楊婷等［18］應用DDRT－PCR技術研究補腎益腦片提取物作用后，SAM P10/Ta小鼠原代培養的神經細胞基因表達的變化情況。共發現了10個差異片段，通過分析鑒定認為補腎益腦片抗衰老作用的發揮可能通過影響與衰老相關的基因表達來實現。

2.3 中藥植物生物學的研究

藥用植物是中藥來源和質量的基礎保障，對于藥用植物的生物學研究有助于對其發育生物學的各項特征和藥理、藥效方面特征的把握，有利于提高中藥材的質量和產量。近十幾年來，將DDRT－PCR技術應用于藥用植物生物學的研究也收獲了較多成果。

M Kakinuma等［19］利用 DDRT－PCR 技術研究了熱和鹽脅迫下孔石莼不育突變體生理生化的改變。J Xu等［20］利用DDRT－PCR技術研究鑒定了龍葵幼苗鎘應答的基因。盛瑋等［21］利用DDRT－PCR技術，分離并克隆半夏試管小塊莖發育過程中表達的相關基因片段，得到15個特異表達的cDNA片段。通過同源性比照發現其中6個在GeneBank中沒有與之匹配的同源序列，可能為新的cDNA片斷。3個片段分別與真核生物啟動子、MADS－box蛋白及乙烯信號轉導因子具有較高的同源性，并在半夏塊莖形成不同天數高度特異表達。李標等［22］利用DDRT－PCR技術研究瘤菌屬菌根真菌AR－18促進藥用植物福建金線蓮生長發育的分子作用機制，運用重擴增、反式Northern點雜交等篩選，發現5條上調表達基因，其中包括編碼尿磷酸核苷轉移酶基因(UPRTs;EC2.4.2.9)、編碼氨基酸跨膜轉運子的基因、編碼突變酶K(matK)的基因等，并討論了差異表達基因的功能。

3 展望

DDRT－PCR技術在1992年建立以來，一直受到其他技術如基因芯片、抑制消減雜交等的挑戰，而且其自身也存在一定的缺陷。但隨著其實驗技術的不斷改進和完善，高效試劑盒的出現，使這項技術在生物新基因的分離與克隆、基因差異表達等方面的使用頻率越來越高，尤其是對于僅有少量樣品和要對多種不同處理進行比較的情況下，DDRT－PCR仍然是目前篩選差異表達基因最有效的方法。在中藥的研究中，DDRT－PCR技術也可以在以下方面發揮重要作用。

3.1 中藥材的作用機理分析 現在關于這方面已有一些相關的研究，并取得了一定的進展，但仍有相當大的發展空間和較多的研究方向。如果能利用mRNA的差異表達分析中藥作用后細胞或組織在基因水平上的改變與調節，清楚了解中藥最本質的作用機理，相信定能幫助中藥材更好的走向世界。

3.2 增強藥用植物的抗性 中藥材講究綠色天然，對于其栽培過程中施加的農藥和肥料都有一定的要求，正因如此中藥材的病蟲害防治問題常令人困擾。如今DDRT－PCR技術在植物抗性基因的鑒定與克隆方面已取得了很多研究成果［7］，如果有比Bt、Ht等基因更安全有效的抗性基因可以轉入中藥植物中，必將為中藥材的安全性做出更大的貢獻。

3.3 道地藥材形成機理的研究 地道藥材在分子方面的研究往往只局限在應用AFLP、RFLP、RAPD、SSR、ISSR、SNP等分子標記技術上。筆者認為，在基因差異的層次之上，更有必要對其表達水平進行研究，因為基因通常是表達之后才彰顯其作用的。如果分析清楚相同時期道地藥材和非道地藥材在表達水平上的差異，可能對道地藥材形成機理的研究會有很大的幫助。

3.4 藥用植物與內生真菌相互作用機理的研究

1993年美國蒙大拿州立大學Strobel小組首次從短葉紅豆杉(Taxus brevifolian)中分離得到一株能合成抗癌物質紫杉醇的內生真菌，至今，人們已先后從近百種藥用植物中分離得到了多種內生菌，并利用內生菌發酵促進藥用植物或藥材產生了某些重要的天然活性成分。但對于藥用植物和其內生真菌相互作用的機理尚未明確的闡述，DDRT－PCR可以幫助我們從基因表達的水平上做一探求。

除了以上幾個方面DDRT－PCR技術還在藥理研究、復方配伍等方面為中藥的研究開辟了新的思路和途徑?？梢韵嘈?，隨著人們認識的深入和DDRT－PCR技術的完善和普及，DDRT－PCR將在中藥的研究中發揮更為重要的作用。

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