蜜蜂（Apis mellifera）美洲幼蟲(chóng)腐臭病最新研究進(jìn)展

陳 傲 孫 杰 繆曉青

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

蜜蜂中最常見(jiàn)的細(xì)菌病為美洲幼蟲(chóng)腐臭病（American foulbrood，AFB）和歐洲幼蟲(chóng)腐臭病（European foulbrood，EFB）。近兩年來(lái)發(fā)表的文獻(xiàn)中對(duì)美洲幼蟲(chóng)腐臭病的研究較多，該病于1907年確定，目前廣泛發(fā)生于溫帶與亞熱帶地區(qū)的幾乎所有國(guó)家，給這些國(guó)家的養(yǎng)蜂業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。被感染的蜜蜂幼蟲(chóng)在孵化后12.5天出現(xiàn)癥狀，首先體色明顯變化，從正常的珍珠白變黃、淡褐色、褐色甚至黑褐色，同時(shí)蟲(chóng)體不斷失水，最后干癟并緊貼于巢房壁，呈黑褐色難以清除的鱗片狀物。感染美洲幼蟲(chóng)腐臭病的蜂群如果沒(méi)有得到適當(dāng)?shù)闹委煟瑫?huì)導(dǎo)致整個(gè)蜂群的死亡。為了控制美洲幼蟲(chóng)腐臭病的發(fā)生，養(yǎng)蜂生產(chǎn)中使用各種化學(xué)藥物對(duì)蜂群進(jìn)行處理，但是已經(jīng)有很多國(guó)家報(bào)道美洲幼蟲(chóng)腐臭病對(duì)一些化學(xué)藥物產(chǎn)生了抵抗。濫用藥物還會(huì)引起蜂產(chǎn)品污染，因此，這些化學(xué)藥物的使用應(yīng)該受到限制。研究美幼病的流行病學(xué)特征和防治新技術(shù)對(duì)于減少和控制病害的發(fā)生以及在環(huán)境保護(hù)方面具有重要意義。

1 病原

美洲幼蟲(chóng)腐臭病的病原體為擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌原（Paenibacillus Larvae），是一種芽孢形式的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。產(chǎn)生的芽孢有7層結(jié)構(gòu)包圍，這種特殊構(gòu)造使得幼蟲(chóng)芽孢桿菌的芽孢具有特別強(qiáng)的生命力，對(duì)熱、化學(xué)物質(zhì)等有極強(qiáng)的抵抗力，在高溫干燥等惡劣環(huán)境下至少能存活35年。目前已知幼蟲(chóng)芽孢桿菌的基因型至少有5種，且不同基因型的細(xì)菌株系所導(dǎo)致的美洲幼蟲(chóng)腐臭病的流行情況略有不同。Di Pinto， Angela等（2011）對(duì)普利亞（意大利）蜂蜜和子脾中的擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的的發(fā)生和分布進(jìn)行了調(diào)查。通過(guò)ERIC-PCR對(duì)擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的基因分型進(jìn)行研究，產(chǎn)生了四種不同的ERIC帶型（ERIC-A，ERIC-B，ERIC-C，ERIC-D），包括200-3000 bp范圍內(nèi)的片段。基因型會(huì)影響擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的感染，蜂群或蜂場(chǎng)的多基因型通過(guò)影響臨床癥狀發(fā)展的類型和速度可能會(huì)增加擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌感染的復(fù)雜性。不同基因型的幼蟲(chóng)芽孢桿菌可以通過(guò)PCR技術(shù)和16SrRNA的編碼基因的限制性酶切片段多態(tài)性加以區(qū)別鑒定。

Douglas W. Dingman（2012）對(duì)從134株擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌菌株中提取的基因組DNA擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)16S–23S rDNA基因間存在三個(gè)基因間隔（ITS）區(qū)域，意味著擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌中至少有三種類型的rrn操縱子，23S rRNA基因通過(guò)I-CeuI消化顯示，基因組DNA的脈沖場(chǎng)凝膠電泳具有7個(gè)拷貝，這顯示擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌基因組具有7個(gè)rrn操縱子拷貝。對(duì)擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的16S–23S rDNA的ITS區(qū)域的研究可以輔助病原的診斷。

2 流行病學(xué)特征

美洲幼蟲(chóng)腐臭病是由幼蟲(chóng)芽孢桿菌這種特殊的芽孢引起的，而不是它的營(yíng)養(yǎng)體。幼蟲(chóng)孵化后48h內(nèi)，即1日齡和2日齡的幼蟲(chóng)對(duì)擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌芽孢非常敏感，不足10個(gè)芽孢就可以使蜜蜂幼蟲(chóng)發(fā)病，并殺死幼蟲(chóng)，但是侵染2日齡以上的幼蟲(chóng)，則需要數(shù)以百計(jì)的芽孢。早期報(bào)道稱擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的孢子在蜜蜂幼蟲(chóng)中腸內(nèi)萌發(fā)，并通過(guò)吞噬作用進(jìn)入上皮細(xì)胞后快速繁殖，最后殺死幼蟲(chóng)。但是，最近有報(bào)道稱，擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌是通過(guò)細(xì)胞旁擴(kuò)散途徑破壞蜜蜂幼蟲(chóng)中腸上皮壁而進(jìn)入中腸組織。Karina等（2009）報(bào)道，擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌主要致病因子是一些胞外分泌的蛋白酶（PP1、PP2），研究表明，這些蛋白酶為含鋅的金屬蛋白酶，屬典型的多聚蛋白酶。幼蟲(chóng)芽孢桿菌在蜜蜂群內(nèi)以水平傳播和垂直傳播兩種方式進(jìn)行傳播，而在群間的傳播則主要是通過(guò)垂直傳播。擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的這種傳播方式使得它成為蜜蜂一種傳染性極強(qiáng)的疾病。由于芽孢只要在適宜的環(huán)境下就能萌發(fā)，所以美洲幼蟲(chóng)腐臭病的發(fā)生沒(méi)有一定的季節(jié)性，病害能在一年中的任何一個(gè)有幼蟲(chóng)的季節(jié)都有可能發(fā)生，但是一般在夏、秋季節(jié)發(fā)生的相對(duì)較多。

3 病原鑒定

對(duì)于擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的鑒定，早些時(shí)候一般是通過(guò)生化手段或分離培養(yǎng)的方式進(jìn)行鑒定。由于擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，現(xiàn)在主要通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。Dobbelaere W 等（2001）發(fā)展了一種以16SrRNA編碼基因片段為引物的PCR技術(shù)來(lái)鑒定幼蟲(chóng)芽孢桿菌的方法，實(shí)驗(yàn)證明該方法快速、可靠，在4小時(shí)內(nèi)就能做出正確的診斷。Alippi等（2004）設(shè)計(jì)的1對(duì)引物KAT1和KAT2的特異性非常強(qiáng)，可以鑒別出擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的不同亞種。經(jīng)過(guò)不斷的完善和改進(jìn)，目前PCR技術(shù)可以在蜜蜂幼蟲(chóng)尚未發(fā)病時(shí)檢測(cè)出低濃度的芽孢，使得PCR成為目前研究美洲幼蟲(chóng)腐臭病的最佳選擇。

4 防治

由于美洲幼蟲(chóng)腐臭病的危害極大，因此如何防治的問(wèn)題一直受到人們的高度重視，其中抗生素為使用最多、應(yīng)用最廣的藥物。自1944年以來(lái)，硫胺噻唑、土霉素、林可霉素、泰樂(lè)菌素、磺胺類、紅霉素等抗生素相繼被用于美洲幼蟲(chóng)腐臭病的治療中。然而，抗生素會(huì)在蜂產(chǎn)品中殘留，影響蜂產(chǎn)品的質(zhì)量，給人類的健康造成威脅。除此之外，抗生素還會(huì)使蜜蜂的抗藥性增強(qiáng)，導(dǎo)致病原體產(chǎn)生變異，使得蜂群患病更加嚴(yán)重。因此，尋找其他更好的藥物和途徑來(lái)治療美洲幼蟲(chóng)腐臭病顯得非常必要。Katarina等（2001）報(bào)道從蜂王漿中分離出的一個(gè)多肽片段可以做為抑制美洲幼蟲(chóng)腐臭病的潛在因子。2002年，Bachanova K等通過(guò)多聚酰胺凝膠上細(xì)菌生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)證實(shí)了蜂王漿中的抗菌肽抑制幼蟲(chóng)芽孢桿菌生長(zhǎng)的活性。Gallardo GL等（2004年）報(bào)道從蜂房花粉中分離出的兩個(gè)真菌株系L一細(xì)交鏈孢菌酮酸（L-Tenuazonic acid）對(duì)幼蟲(chóng)芽孢桿菌的生長(zhǎng)具有特殊的抑制能力。Aronstein A等（2004）報(bào)道蒜素（Allicin）能在一定程度上抑制幼蟲(chóng)芽孢桿菌生長(zhǎng)，從而減少美洲幼蟲(chóng)腐臭病的發(fā)生。李位三等（2008）報(bào)道從半枝蓮、大黃、黃柏等中草藥提取有效成分，配制成的“蜂幼康”顆粒劑對(duì)美洲幼蟲(chóng)腐臭病等細(xì)菌病有很好的防治作用。

2012年3月，美國(guó)食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)通過(guò)了LINCOMIX可溶性粉作為治療美洲幼蟲(chóng)腐臭的新藥物，由美國(guó)農(nóng)業(yè)部的蜜蜂研究實(shí)驗(yàn)室與NRSP-7進(jìn)行合作對(duì)該藥物進(jìn)行研究，為該藥物的批準(zhǔn)提供支持，證明LINCOMIX可溶性粉在控制蜜蜂AFD時(shí)是安全和有效的。Benitez等（2012）報(bào)道幼蟲(chóng)芽孢桿菌LBM5006產(chǎn)生的一種抗菌因子可以有效地抑制擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌，質(zhì)譜分析表明，抗菌活性與伊枯草菌素肽類有關(guān)。Mikio Yoshiyama等（2012）從發(fā)酵物料和食物中分離出乳酸菌（LAB）研究其在活體外對(duì)擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的抑制作用，結(jié)果表明，有9種菌株抑制了擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的體外生長(zhǎng)。通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR對(duì)菌株進(jìn)行篩選，將篩選出的LAB對(duì)幼蟲(chóng)和成蜂進(jìn)行口服給藥后，發(fā)現(xiàn)抗菌肽基因如abaecin， defensin和hymenoptaecin的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。Mikio Yoshiyama等（2012）研究發(fā)現(xiàn)蜂膠乙醇提取物能顯著抑制擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌在體外生長(zhǎng)，抑菌強(qiáng)度不僅與蜂膠中化合物的含量有關(guān)，與黃酮類化合的之間顯著的交互影響作用也有一定的關(guān)系。Sabate，D C等（2012）研究表明甘菊花中的揮發(fā)油、己烷（HE）、和苯提取物可以抑制擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌，HE表現(xiàn)出最高的抗擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的活性。由枯草芽孢桿菌C4和甘菊花中的HE合成的具有生物表面活性劑的表面活性素在抑制擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌方面具有協(xié)同作用。

5 討論

（1）通過(guò)PCR技術(shù)可以對(duì)擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷，但是在不同地區(qū)，擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌存在很多不同的基因型，不同基因型的擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌引起的蜂群患病情況可能有所不同，有必要通過(guò)PCR技術(shù)及DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌進(jìn)行基因序列分析，并繪制其基因圖譜。

（2）雖然很多國(guó)家已經(jīng)出臺(tái)了相關(guān)法規(guī)限制抗生素的使用，但是蜂產(chǎn)品中抗生素超標(biāo)的問(wèn)題還是屢見(jiàn)不鮮。越來(lái)越多的研究者加入到探索對(duì)環(huán)境危害小、對(duì)人畜安全的新藥物的行列中，也發(fā)現(xiàn)了一些能抑制擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌生長(zhǎng)的制劑和活性因子，如蜂膠乙醇提取物、乳酸菌、枯草芽孢桿菌C4和甘菊花提取物中的表面活性素等等，實(shí)驗(yàn)證明它們確實(shí)能對(duì)擬幼蟲(chóng)芽孢桿菌的活性產(chǎn)生抑制，但是具體是哪些活性成分在起作用，各活性成分與抑菌效果的關(guān)系，以及抑制機(jī)制等問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。

（3）如何將那些安全高效的蜂用抗菌藥物使用到大規(guī)模養(yǎng)蜂生產(chǎn)中，以及藥物的用法、用量、用藥周期等問(wèn)題還有待進(jìn)一步的實(shí)踐驗(yàn)證。

[1] 陳盛祿. 中國(guó)蜜蜂學(xué). 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社. 北京. 2001. 592—593．

[2] 李位三, 張啟明, 王啟發(fā), 等. 2008. 中草藥制劑“蜂幼康”防治蜂病效果及其機(jī)理的研究[J].蜜蜂雜志.10: 5-6

[3] Anonymous. New Antibiotic For AFB[J]. Bee Culture.2012. 75-75.

[4] Alippi, A.M., Is Terramycin losing its effectiveness against AFB? The Argentinean experience. Bee Biz. 2000. 11: 27-29.

[5] Alippi AM, Lopez AC, Aguilar OM. Differentiation of Paenibacillus larvae subsp larvae, the cause of American foulbrood of honeybees,by using PCR and restriction fragment analysis of genes encoding 16S rRNA [J]. Applied and Envimnmetal Microbiology. 2002. 68(7):3655-3660

[6] Aronstein A, Hayes G. Antimicrobial activity of allicin against honey bee pathogens[J]. Journal of apicultural research.2004. 43: 57-59.

[7] Bakhiet, Smhly. Uhrastructure of sporulating Bacillus larvae in a broth medium [J]. App1. Environ． Microbio1. 1985.50: 690-692

[8] Benitez, L.B., Velho, R.V., Souza da Motta, A, et al. Antimicrobial factor from Bacillus amyloliquefaciens inhibits Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood[J]. Archives of Microbiology2012. 194 (3): 177-185

[9] Cristina M.M., Liviu Al. M., Daniel S. D, et al. Journal of Invertebrate Pathology[J]. 2012. 110: 68-72

[10] Dobbelaere W, de Gram DC, Peetem JE, Jaeobs FJ. Development of a fast and reliable diagnostic method for American foulbrood disease(Paenibaeillus larvae subsp larvae)using a 16S rRNA gene based PCR. Apidologie.2001. 32(4): 363-370

[11] Di Pinto, Angela; Novello, Lucia; Terio, Valentina, et al. ERICPCR Genotyping of Paenibacillus larvae in Southern Italian Honey and Brood Combs [J]. Current Microbiology 2011.63( 5): 416-419

[12] Douglas W. Dingman. Paenibacillus larvae 16S-23S rDNA intergenic transcribed spacer (ITS) regions: DNA fingerprinting and characterization(J). 2012.110: 352-358

[13] Evans, J.D., Diverse origins of tetracycline resistance in the honey beebacterial pathogen Paenibacillus larvae[J]. Invertebr. Pathol.2003.83, 46-50.

[14] Evans, J.D., Lopez, D.L., Bacterial probiotics induce an immune response in the honeybee (hymenoptera: Apidae). J. Econ.Entomol.2004. 97, 752-756.

[15] Gallardo I, Pena I, Chacana P, et al. L-Tenuazonic acid, a new inhibitor of Paenibaeillus larvae[J]. World Journal of Microbiology &Biotechnology. 2004.20:609-612

[16] Genersch E, Ashiralieva A, Fries I. Strain- and Genotype-Specific Differences in Virulence of Penibacillus larvae subsp.Larvae, a Bacterial Pathogen Causing American Foulbrood Disease in Honeybees[J].Applied and Environmental Microbiology.2005.71(11):7551-7555

[17] Genersch, E., Forsgren, E., Pentikainen, J., Ashiralieva, A., Rauch,S., Kilwinski, J., Fries,I., Reclassification of Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsp. larvae as Paenibacillus larvae without subspecies differentiation. Int. J. Syst.Evol. Microbiol. 2006. 56, 501-511.

[18] Karian A, Matilde A, Geraldine S, et al. Characterizatiion of secreted proteases of Paenibacillus larvae, potential virulence factors involved in honeybee larval infection[J].Journal of Invertebrate Pathology.2009.102:129-132.

[19] Katarina B, Gusui W, Jozef S. Isolation of a peptide fraction from honeybee royal jelly as a potential antifolbrood factor[J]. Apidologie,2001. 32:275-283.

[20] Mikio Yoshiyama, Meihua Wu, Yuya Sugimura, et al. Inhibition of Paenibacillus larvae by lactic acid bacteria isolated from fermented materials[J]. Journal of Invertebrate Pathology.2012. 12: 1-6

[21] Miyagi, T., Peng, C.Y., Chuang, R.Y., Mussen, E.C., Spivak, M.S.,Doi, R.H., Verification of oxytetracycline-resistant American foulbrood pathogen Paenibacillus larvae in the United States[J].Invertebr. Pathol. 2000.75, 95-96.

[22] Queenie W T, Andony P M，Stephen F P, et al. The innate immune and systemic response in honey bees to a bacterial pathogen,Paenibacillus larvae[J]. BNC genomics.2009. 387(10): 1-9

[23] Yue D, Nordhoff M, Wicler L, et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) analysis of the interactions between honeybee larvae and Paenibacillus larvae, the causative agent of American foulbrood of honeybees(Apis mellifera).Environ Microbiol.2008. 10:1612-1620