中藥復方藥效物質基礎研究方法探討

楊炳烈付天靈

（1 內蒙赤峰65655部隊醫院，內蒙 赤峰 024000；2 內蒙赤峰紅山中醫院，內蒙 赤峰 024000）

中藥復方藥效物質基礎研究方法探討

楊炳烈1付天靈2

（1 內蒙赤峰65655部隊醫院，內蒙 赤峰 024000；2 內蒙赤峰紅山中醫院，內蒙 赤峰 024000）

中藥復方藥效物質基礎研究為中醫藥研究領域的重點及難點，近年來許多專家學者對此進行了大量研究與實踐。本文回顧分析了近十年來有關中藥復方藥效物質基礎研究的相關文獻，對中藥復方藥效物質基礎研究所采用的新技術、新方法和研究中存在的問題進行綜述與探討。

中藥復方；藥效物質基礎；綜述

中藥復方是中醫臨床用藥的主要形式，其獨特的療效和復雜性等成為中醫藥研究領域的熱點和難點。長期以來，對方劑發揮臨床療效實質的闡明多以中醫藥理論來解釋，未能從微觀層次上說明其發揮藥藥效的物質基礎及原理，難以被國際社會所接受及應用[1]。因此，中藥復方藥效物質基礎的發現與辨析，一直是中醫藥基礎研究與新藥研發的關鍵[2]。中藥的復雜性決定了它多成分、多靶點、整合調節的優勢和特色，同時機體整體調控的復雜性也存在一個逐漸被認識、被解析的過程。正是由于中藥成分和機體調控的復雜性，中藥的藥效物質、作用環節以及物質配伍關系的闡明也是當前藥學研究工作的巨大挑戰。中藥復方藥效物質基礎研究傳統使用的方法主要為拆方研究法[3-5]和整方研究法[6-8]，并取得了一定進展。隨著科學技術的發展，近年來一些新方法逐漸應用于復方效應物質基礎研究之中。本文對該領域的十年來研究現狀進行了綜述，并對其發展進行展望。

1 代謝研究法

口服的中藥復方成分在消化道內，一些成分經相應的腸內菌群作用代謝轉化后被吸收，另一些成分則以原型被吸收；吸收后的成分在肝臟解毒后經膽汁排泄，與腸內菌接觸發生結合、裂解等代謝轉化后再次被吸收；還有些成分不被胃腸吸收而直接被排泄掉[9]。代謝研究法的思路之一是用整體動物進行代謝研究，即通過給藥后對動物血液、尿、膽汁、胃液、腸液、糞便等進行分析、分離，從而發現復方在體內真正發揮藥效的物質，進而研究物質基礎和復方作用機制[10]；思路之二是在體外模擬體內條件進行代謝研究，即通過分析復方在人工胃液、腸液及腸道菌叢中可吸收成分及其轉化特征，結合藥效學的結果分離中藥復方有效成分[11]。最近，越來越多的研究顯示，許多復方中的天然成分經過腸道菌代謝后才具有生物活性，而代謝研究法可以有效地排除大量的無效成分的干擾從而更加快速的發現真正起作用的有效成分。例如，對人體服用小柴胡湯后血漿的研究發現了原方中沒有的一些新化合物，如黃芩苷的新代謝物黃芩苷元6-O-硫酸酯等[12]；對參附湯體內代謝的化學成分進行的研究發現，大鼠口服參附湯后，烏頭類生物堿卡米查林、塔拉胺、附子靈以原型形式被吸收，而人參皂苷則是經腸內細菌代謝后以代謝產物Compound K形式吸收進入體內，且均通過尿液排出體外[13]。

2 血清藥理學和血清藥物化學方法

中藥血清藥理學和血清藥物化學認為，中藥復方成分雖然復雜，但進入體內且被檢測到的化學成分的數量是有限的[10]。進入血液的成分構成血清“粗提物”，包含復方制劑的原型單體、加工炮制和煎煮過程產生的產物、腸內菌代謝產物，以及它們對機體直接作用后產生的生理活性物質[14]。運用血清藥理學和血清藥物化學研究方法研究復方物質基礎取得了許多有價值的研究成果。最近，對冠心II號含藥血清進行HPLC分析，發現該制劑的血清成分譜數目有限：從給藥動物血清中只測出川芎嗪、阿魏酸、丹參素、原兒茶醛、芍藥苷等9種成分[15]；對茵陳蒿及其復方進行的血清藥物化學研究發現：口服給藥后，具有促進膽汁分泌作用的6，7-dimethylesculetin （6，7-DME）被大量吸收入血（生物利用度為62.4%），其他藥物成分可能在其他環節對6，7-DME產生影響，但在血液中并未檢出，由此認定6，7-DME為茵陳蒿及茵陳蒿湯的效應物質基礎[14]。血清藥理學和血清藥物化學的研究結果，不僅可闡釋藥效物質基礎，還可通過各種適宜的方法（化學合成、水解、酶解及細菌代謝等）制備活性成分，進而參考血清有效成分的比例和濃度，配制新的中藥制劑。

血清藥理學和血清藥物化學研究方法，排除了復方制劑及其粗提物本身復雜的理化性質（如各種電解質、鞣質、pH值、滲透壓等）的干擾，排除了胃腸中不能進入血清的藥物成分，使中藥復方效應物質基礎問題得到簡化[9]；含藥血清包含了復方真正的有效成分，避免了復方及其粗提物體外實驗中諸多因素的影響，能較準確、真實地反映復方的藥效、作用機制及藥代動力學。然而，該法在實際運用中也遇到了很多問題。不可否認，在血清中檢測到的“成分”可能是無效物質或是有效物質的代謝產物；而且，某些吸收入血檢測到的成分，經過富集和提純后，需加到比原來血清中的濃度高許多倍時才顯示相關藥理作用[16]，這給有效成分的確定帶來困難。此外，不同種屬、年齡的動物對藥物吸收的差異，不同給藥劑量、采血時間造成的血藥成分、濃度的差異，加上血清內源性成分的干擾，給血清有效成分的分離鑒定造成了相當大的困難[11]。因此，我們認為中藥血清藥理學和血清藥物化學雖是一種很有發展前途的方法，但許多問題尚待今后系統深入的探討。

3 黑箱分析法

“黑箱分析法”采用反向思維模式，不再把研究的重心放在分離、純化各種有效成分上，而是通過研究服藥后機體受到影響而出現的新的效應分子（蛋白質），來確定最終起治療作用的物質[17]。該法是通過分析單味藥及復方的化學成分（輸入）和血清或病變組織器官中與療效相關的效應成分（輸出）的關系，找出復方的物質基礎[18]。實際操作中，先獲得復方全成分化學信息，再利用計算機將復方成分與藥理實驗數據特別是蛋白質等效應分子的結構和功能進行相關，并對單味藥和各種不同配伍復方化學成分進行比較和歸納，尋找化學成分與活性的關系規律，從而闡明復方的作用物質基礎。與其他技術結合運用，黑箱分析法取得了良好效果。肖紅斌等在中藥復方全成分黑箱分析基本思路的基礎上，運用智能多模式多柱色譜系統（MMCC）及其聯用技術探討了當歸補血湯效應物質基礎[19]。與其他方法相比，黑箱分析法忽視了組成復方的各單味藥之間的相互配伍和平衡關系。盡管如此，該法獨到的研究思路在復方效應基礎研究中將發揮應有的作用[18]。

4 分子生物色譜技術

與傳統的色譜技術利用分子間的物理作用分離化合物不同，該技術是基于生物大分子的特異性識別和相互作用來分離和測定活性化合物，在中藥特別是復方活性成分的分離鑒定中具有廣泛用途[20]。其操作過程是將生物體內活性物質（如酶、受體、運輸蛋白和其他具有重要生理功能的生物大分子）固定于色譜填料中，中藥復方提取物經過色譜柱后，經過特異識別、結合和分離，最終被分離鑒定[11]。如，將以人血清白蛋白為配基的生物色譜篩選方法運用于Artemisia capillaris Thunb.有效成分的研究，獲得了有生物活性的有效成分scoparone和capillarisin[21]。分子生物色譜中藥物在柱上的保留行為直接與活性相關，對生理學和藥理學研究具有特別意義。分子生物色譜不僅可研究復方效應物質基礎，還有助于闡釋藥物的分布、排泄、代謝、活性、毒副及體內生物轉化。如，將肝微粒體固載于色譜擔體上，可研究中藥成分在生物體內可能發生的生物轉化。由于分子生物色譜可用粗提液直接進樣，簡便快速，重現性好，在中藥復方物質基礎研究中具有巨大的應用潛力[22]。

5 中藥組合化學技術

該方法是在組合化學技術的啟發下提出的，即以中藥復方天然組合化學庫的多靶作用機制為依據，在中醫藥理論的指導下，采用反映方劑主治病證的藥理學指標，通過組分或單體成分的組合篩選，找出其活性最強的有效組分構件[23]。中藥復方成分是由多種結構類型的組合化學庫組成的分子庫。許多植物藥已能分離鑒定出100種左右的化學成分，因此，一個由4～5味中藥組成的復方，就可能含有500種左右的化學成分，包括有效成分和無效成分，而且在加工炮制過程中可能產生新的成分[24]。不同種屬的植物（藥材）中成分的結構類型有其特征，但有類似性和規律性，如“黃酮結構類型”、“三萜結構類型”、“吲哚生物堿結構類型”等。通過初步的化合物類型的分離，可用生物活性篩選的手段直接從個別庫中“釣”出有活性的化合物（如用有熒光標志的化合物受體從庫中“釣”取能與之結合的化合物），或通過類似于親和層析的方法直接從庫中吸附有相互作用的化合物，再分別測定各類化合物的結構和生物活性，經過分析和歸納，最終闡明復方作用物質基礎[3]。有人采用二元索引庫篩選法對川芎、天麻提取物的復方組合化學進行了探索研究，結合血清藥理學方法，找出了活性最強的兩組構件，即川芎醇提物+天麻醇提物是組合復方抗血小板釋放5-HF作用和阻滯血管內皮細胞鈣通道作用的基本構件。中藥復方的組合化學研究，體現了復方多組分協同的特點，簡化了方劑的分子多樣性，具有很強的操作性，簡便、快速、高效。

6 多靶點篩選與中藥生物芯片技術

多靶點篩選的方法就是針對中藥復方多成分調節作用的多靶點特性，通過配體-受體的藥物研究理論，進行藥效物質作用靶點分析或有效成分的篩選、確定。這是一個從深層次揭示復方效應物質基礎及作用機制的研究思路。需要指出的是，中藥復方配伍的作用靶點極其復雜，特別是其有效成分并不一定是與受體結合，有可能通過改變“環境”或一個成分影響另一個成分對受體的作用等形式影響受體的功能[25]，這給有效成分的研究帶來相當大的困難。令人欣慰的是由于近年來生物芯片技術的發展，以基因、受體、酶等為藥物作用靶點的高通量篩選技術，在中藥有效成分篩選、分離、發現等的研究中將發揮更大作用。

近些年生物芯片技術的發展和應用為中藥研究提供了新的手段，特別是生物芯片技術高通量、多因素、微型化和自動化的特點，給中藥復方分析帶來了極大的便利[26]。生物芯片技術可以把復雜的混合化學物質分為幾類，使得篩選工作更加簡便，如根據中藥不同化學成分的分離條件，可設計不同成分（如生物堿、醌類、黃酮、皂苷等）提取、分離、鑒定的分析用生物芯片；也可設計同時分離各種成分的綜合分析用生物芯片，用于單味藥成分篩選性分析，復方歸類分析等；還可針對某味藥材的多種組分設計用于該藥材分析和鑒定的中藥材芯片[27]。目前，國內已有人利用基因芯片對中藥復方—黃連解毒湯進行了嘗試性研究[28]。特別指出的是，以生物芯片技術為基礎的多靶點高通量篩選技術在中藥有效成分研究中潛力巨大。

7 數據庫與計算機技術相結合

周家駒等[29，30]對中藥傳統功效、有效成分及現代藥理學研究等資料進行整合，建立起一套中草藥化學資料的辨識和分析規范，并據此研制了中藥化學數據庫（Traditional Chinese Medicine Database，TCMD），TCMD可提供中草藥所含成分化學結構、理化性質、生物活性、藥理活性以及文獻來源等信息，大大提高了中藥復方研究效率，是研究中藥復方的有用工具。中國科學院聯合軟件開發在MDL化學信息管理系統基礎上建立了中國天然產物數據庫（CNPDTM），為中國的新藥、天然產物及中藥復方等相關研究提供了天然產物、生物活性數據、原植物來源及中藥傳統應用融為一體的信息。現已用于虛擬篩選方法發現活性化合物的研究[31]。徐筱杰等[39]建立了用于中藥復方研究的計算機系統，該系統包括中草藥成分三維結構數據庫、受體三維結構數據庫、代謝庫、具有生物活性數據的化合物數據庫為核心的知識庫系統；以分子對接為核心的分子間相互作用計算機模塊；以三維定量構-效關系（3D-QSAR）為核心的構-效關系及分子相似性研究單元等計算模塊。該系統對于研究復方組分間相互作用，復方成分及可能形成復合物的三維結構，確定復方有效成分及其中藥組分在體內的代謝研究提供了大量數據信息，有助于中藥復方物質組成和作用機制研究。

8 分子烙印技術分離中藥復方有效部位

分子烙印技術是根據特定目標分子（即模板分子）制備具有高度親和性聚合物材料（MIP）的技術。MIP存在與模板分子空間結構互補，功能團相互作用（氫鍵、離子或范德華力等）的聚合物孔穴。MIP與模板分子的作用類似于酶和底物的結合，對模板分子具有較強親和性及識別能力。目前，MIP作為固相提取材料從中藥復方中分離有效部位尚屬新穎。謝建春等[33]嘗試以丙烯酰胺作為功能單體，以槲皮素為模板，在極性溶劑中，用非共價鍵法制備了MIP。結果表明，MIP對槲皮素具有特異親和性，將該MIP直接分離銀杏葉提取物水溶液，得到主要含模板槲皮素及其結構類似化合物山奈酚兩種黃酮類組分。利用MIP特異親和性從中藥復方中提取、分離具有相同空間結構、相似功能團的有效部位，將會成為中藥復方有效部位提取、分離的有效手段。

9 小結與展望

近年來，中醫藥研究者對中藥復方的藥效物質基礎進行了大量研究，已經取得了一定的成績，但是中藥復方藥效物質基礎的研究仍存在以下問題：由于中藥復方組方的復雜性，研究者對其藥效物質基礎的認識還難以統一，加之有效成分含量低微，使其在體內外難以檢測；此外，中藥復方是在整體觀念指導下的一個藥效物質整體，目前研究所采用的只對其中一至兩個成分進行定性定量檢測與評價，難以反映中藥復方藥效物質的整體；中藥復方是在中醫藥理論指導下，以辨證論治為原則，因證組方，但在動物實驗研究中，證的模型相對于疾病模型欠成熟，缺乏較系統的研究。盡管由于中藥復方化學成分的復雜性使得中藥復方藥效物質基礎的研究困難重重，但近年來多學科的互動與交融，新技術、新方法的出現及在中醫藥研究領域的廣泛應用，為復方的研究發展帶來了新的思路和發展。特別是隨著中藥血清藥理學和血清藥物化學研究方法的進一步成熟，結合中藥組合化學檢測方法及手段的進一步發展，在不久的將來中藥復方藥效物質基礎的闡明將逐漸變為可能。

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