五味子總木脂素與順鉑抑制大鼠膠質瘤細胞增殖的作用

金 宏 信 宏 于洪泉 溫 娜 唐澤波 齊 玲 劉興吉 (吉林醫藥學院，吉林 吉林 303)

五味子總木脂素是中藥材五味子中的重要組成成分。近年研究表明，五味子總木脂素具有很強的生物學活性，具有抗腫瘤〔1〕、保護肝臟和抗氧化作用、抗病毒作用、對中樞神經系統的抗抑制和抑制作用，以及抑制平滑肌收縮和增強免疫功能、促進蛋白質合成、促進糖原合成等多種作用〔2〕。但該藥物通過何種方式發揮其各種作用目前尚不明確。本實驗旨在研究五味子總木脂素作用于大鼠C6腦膠質瘤細胞后發生的效應，以及該藥協同常規化療藥物順鉑作用后細胞的反應，為該藥早日應用于臨床奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 細胞培養基RPMI-1640(Thermo公司)、小牛血清、0.25%胰酶(美國Gibco公司);順鉑(阿拉丁公司，中國)，四甲基偶氮唑藍(MTT，Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，Thermo公司)。

1.2 細胞培養 將配制好的RPMI-1640培養基置于培養箱中預熱，自-80℃冰箱中取出大鼠腦膠質瘤C6細胞，迅速置于37℃水浴至融化，離心后小心吸出上清，將細胞用1 ml培養基混勻放入培養皿中，再加入9 ml新鮮培養基，輕輕混勻后放入5%CO2、37℃培養箱中進行培養。倒置顯微鏡下觀察細胞生長良好，待80% ～90%融合時進行傳代。

1.3 MTT法檢測五味子總木脂素對大鼠膠質瘤細胞的作用將五味子總木脂素用含5%小牛血清RPMI-1640細胞培養液溶解后，配制成終濃度為 0、50、100、200 μg/ml的藥物。取對數生長期的腦膠質瘤C6細胞，用胰酶消化后，用含5%小牛血清RPMI-1640細胞培養液調整細胞濃度為8×103/ml。將細胞懸液均勻接種于96孔板中，每孔100 μl，置入37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，使細胞同步化。棄去上清液，加入含不同濃度的五味子總木脂素，每個藥物濃度重復5次。藥物作用結束時，每孔加入 MTT 20 μl，37℃ 繼續孵育 4 h，棄上清液，每孔加DMSO 150 μl，振蕩均勻使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶聯免疫檢測儀上490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值，用不加細胞的空白孔調零。

1.4 MTT法檢測五味子總木脂素聯合順鉑對膠質瘤細胞的作用 將細胞以8×103個/孔接種于96孔板培養24 h后，將細胞分為四組，分別為五味子總木脂素組(200 μg/ml)，順鉑組(10 μg/ml)，聯合用藥組(五味子總木脂素 200 μg/ml+順鉑10 μg/ml)，對照組使用基礎培養基。余下步驟同1.3。

1.5 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行分析，實驗結果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD、DUNCAN法和t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠膠質瘤細胞株C6細胞的培養 大鼠膠質瘤C6細胞經復蘇后培養，細胞在復蘇2 h開始貼壁，初期呈圓球形，隨著時間的延長，細胞逐漸出現突起，開始呈現長梭形，24 h后90%以上的細胞都已貼壁，大部分可見明顯的突起。

2.2 大鼠膠質瘤C6細胞對五味子總木脂素的敏感性 大鼠膠質瘤細胞在藥物低濃度(0.50 μg/ml)時無明顯的抑制效應發生，OD值分別為0.69±0.03、0.78±0.03，甚至出現輕微的增殖現象，藥物濃度達到100 μg/ml時促進增殖作用明顯(0.83±0.03)(P ＜0.01)，但當藥物濃度達到200 μg/ml時，細胞開始出現明顯的生長抑制(0.53±0.03)(P＜0.01)，說明五味子總木脂素在低濃度時可以促進細胞增殖，而藥物濃度達到200 μg/ml時，抑制細胞生長。

2.3 五味子總木脂素聯合順鉑對膠質瘤細胞的作用 大鼠C6膠質瘤細胞經五味子總木脂素作用后，其OD值為0.53±0.03，順鉑組OD值為0.64±0.03，木脂素與順鉑聯合組為0.43±0.01，與對照組(0.75±0.04)相比，具有顯著性差異(P＜0.01)，而且兩藥聯合應用效果更為顯著，說明五味子總木脂素與順鉑聯合應用在治療膠質瘤方面具有協同作用。

3 討論

腦膠質瘤是發生于神經外胚層的腫瘤，發病率約為40.49%，綜合發病年齡高峰在30～40歲或10～20歲。世界衛生組織公布按死亡率順序排位，惡性膠質瘤是34歲以下腫瘤患者的第2位死亡原因，是35～54歲患者的第3位死亡原因。膠質瘤系浸潤性生長物，它和正常腦組織沒有明顯界限，難以完全切除，對放療、化療不甚敏感，非常容易復發。化學藥物和一般抗腫瘤的中藥，因血腦屏障等因素的影響，療效也不理想。因此，腦膠質瘤至今仍是全身腫瘤中預后最差的腫瘤之一。

研究表明，中藥五味子具有毒性低〔3〕和明確的抗腫瘤作用〔4～6〕。本研究發現，五味子總木脂素在低濃度時對膠質瘤細胞無明顯的抑制作用，甚至出現輕微的增殖現象，當藥物濃度增加到200 μg/ml時，細胞生長出現明顯的抑制，這一結果與之前的研究結果一致〔7〕。提示高濃度五味子總木脂素可以有效抑制腫瘤細胞增殖。

順鉑是傳統的抗腫瘤藥物，但是臨床用藥表明，大劑量應用順鉑時其毒副作用較明顯，人體難以耐受，導致部分患者難以達到理想的治療效果。本課題組發現，五味子總木脂素聯合順鉑能更加有效地抑制腫瘤細胞增殖，具有極強的殺傷膠質瘤細胞的能力。這一結論與呂冬霞等〔8〕研究結果一致。本實驗有力地證實了五味子總木脂素與順鉑可發生協同作用，兩藥聯合應用可以加強藥物的抑瘤作用，但兩個藥物發生協同作用的機制目前還不明確，聯合用藥后是否可以減少順鉑用量，在降低毒副作用的同時達到最好的治療效果，這些都有待于進一步研究。

1 Chiu PY，Lam PY，Yan CW，et al.Schisandrin B protects against solar irradiation-induced oxidative injury in BJ human fibroblasts〔J〕.Fitoterapia，2011;82(4):682-91.

2 吳立軍.天然藥物化學〔M〕.第5版.北京:人民衛生出版社，2009:5.

3 苗明三.五味子多糖對衰老模型小鼠的影響〔J〕.中國醫藥學報，2002;17(3):187-8.

4 李先偉，楊解人.五味子乙素抗H2O2誘導PC12細胞凋亡的機制〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(12):2244-7.

5 任麗佳，李 林，殷放宙，等.五味子抗腫瘤活性成分及作用機制研究進展〔J〕.中國藥理學通報，2012;28(1):140-2.

6 牟遇霖.五味子抗腫瘤的研究現狀〔J〕.中國醫藥導報，2010;7(2):84-5.

7 金 宏，溫 娜，紀鵬艷，等.不同濃度五味子乙素對腦膠質瘤SHG-44細胞增殖的影響〔J〕.中國實驗診斷學，2011;15(12):2026-7.

8 呂冬霞，崔 健，劉月霞，等.五味子乙素聯合順鉑對H22荷瘤小鼠存活時間的影響〔J〕.黑龍江醫藥科學，2008;31(5):9-10.