miR－26a－1 rs7372209基因多態性與冠心病遺傳易感的關系

成 捷 岑錦明 楊希立 荊 霞 劉新光 熊興東 (廣東醫學院衰老研究所，廣東 東莞 5808)

miR－26a－1 rs7372209基因多態性與冠心病遺傳易感的關系

成 捷1岑錦明2楊希立2荊 霞3劉新光1熊興東1(廣東醫學院衰老研究所，廣東 東莞 523808)

目的研究miR-26a-1 rs7372209基因型和等位基因頻率分布，探討miR-26a-1 rs7372209基因多態性與華南地區漢族人冠心病遺傳易感的關系。方法利用聚合酶鏈式反應-連接酶檢測反應(PCR-LDR)分析技術，對295例冠心病患者和283名對照個體的miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態位點進行分型，采用非條件邏輯回歸分析統計該多態位點與冠心病易感的相關性。結果CC、CT、TT基因型在冠心病組中的分布頻率分別為54.6%、37.6%和7.8%，在對照組中分別是57.2%、37.5%和5.3%，兩組間基因型頻率分布差異無統計學意義(χ2=1.554，P=0.460)。攜帶miR-26a-1 rs7372209 T變異等位基因與冠心病的遺傳易感無明顯相關(OR=1.15，95%CI=0.88～1.49，P=0.315)。結論miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態位點與華南地區漢族人冠心病易感無相關性。

miR-26a-1;單核苷酸多態性;冠心病;遺傳易感性

冠心病的危險因素除了常見的高血脂、高血壓、糖尿病和吸煙等外，人們逐漸認識到遺傳背景對冠心病的發生與發展也起到重要的作用〔1〕。而單核苷酸多態性(SNP)是影響個體對疾病易感的重要遺傳因素。研究表明，miR-26a-1 rs7372209多態位點與非小細胞肺癌、結腸癌、膀胱癌和口腔黏膜癌前病變的遺 傳易感 密 切 相 關〔2～5〕。迄 今 為 止，有 關 miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態與冠心病的遺傳易感性尚未見報道。為闡明miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態對冠心病遺傳易感的影響，本研究采用聚合酶鏈式反應-連接酶檢測反應(PCRLDR)技術檢測miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態基因型在華南地區冠心病患者及對照人群中的發生頻率，探討miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態位點與冠心病遺傳易感性的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 包括283例對照組人群和295例冠心病患者的病例組。患者樣本隨機收集自2011年3月至2012年2月在佛山市第一人民醫院治療，并且經冠狀動脈造影等檢查確診為冠心病的患者。冠心病診斷標準參照國際心臟病學會及WHO臨床命名《缺血性心臟病的命名及診斷標準》，冠狀動脈造影時顯示主要動脈中至少有1支內徑狹窄＞50%。對照組是經心臟ECT(心臟核素掃描)、冠脈CTA(CT冠脈成像)或冠狀動脈造影等檢查排除冠心病的個體。所有冠心病患者和正常對照個體均為無血緣關系的華南地區漢族人群，排除先天性心臟病、心肌病、嚴重肝臟和腎臟疾病。每例標本都具備年齡、性別、有無吸煙、有無喝酒、收縮壓和舒張壓、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、冠心病家族史等資料。在標本采集過程中，所有入選個體在入選時均告知其研究方法及其意義，做到知情同意。本研究得到了佛山市第一人民醫院醫學倫理委員會的批準。

1.2 實驗耗材與設備 TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒(TianGen)，Taq DNA聚合酶和DL2000TMDNA Marker(Taka-ra)，Mastercycler?ep PCR 儀(Eppendorf)，ABI PRISM 377 DNA測序電泳儀(ABI)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA抽提 每份樣品均取靜脈血2 ml，EDTAK2抗凝，按照TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒說明抽提外周血基因組DNA。－80℃保存備用。

1.3.2 基因分型 采用PCR-LDR方法對miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態進行基因分型。①rs7372209多態的引物和探針:引物和探針由上海翼和應用生物技術有限公司設計并合成。引物序列:上游:5'TTTGCAAAAGCATCAACTGAA3'，下游:5'ATATCACAGCACAGCCAGGA3'。探針序列:rs7372209(C＞T)_FAM 探針:5'AAGGATTAATTTCTCTCCTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3';rs7372209(C＞T)_C探針:5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATGCTTACAGTCACGTGGTACG3';rs7372209(C＞T)_T探針:5'TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATGCTTACAGTCACGTGG TACA3';② PCR 反應體系20 μl，基因組 DNA 1 μl，dNTP 2 μl，引物各0.5μl，10×PCR緩沖液2μl，Taq DNA 聚合酶0.5μl;PCR反應程序:95℃預變性15 min，然后94℃變性30 s，59℃退火1 min 30 s，72℃延伸 1 min，共 35次循環，最后 72℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察PCR產物的效果，擴增目標片段長度為249 bp，確定其作為模板在LDR反應中加入的量。③LDR反應體系10μl，特異性探針1μl，PCR產物1μl，緩沖液1μl，連接酶0.05μl;LDR反應程序:95℃ 2 min，然后94℃變性15 s，50℃反應25 s，共30次循環。LDR片段長度分別為102 bp，104 bp。④產物經ABI 377電泳測序，結果運用GeneMapper 4.0軟件進行數據分析。

1.4 統計學方法 利用goodness-of-fitχ2檢驗多態位點的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡;冠心病組和對照組中連續性變量資料采用t檢驗進行統計分析，分類變量資料采用χ2檢驗分析。Pearsonχ2檢驗比較冠心病患者與對照組的基因型分布差異;非條件邏輯回歸計算比值比(OR)及其95%置信區間(CI)，分析基因型與冠心病發病風險的關系。所用統計軟件為SPSS13.0軟件。

2 結果

2.1 冠心病組和對照組一般情況的比較 該研究入選對象的性別和HDL-C在冠心病組和對照組中無顯著差異。但收縮壓、舒張壓、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、LDL-C、冠心病家族史、飲酒、吸煙指數中冠心病組顯著高于對照組，提示高血壓、高血脂、吸煙、喝酒等是我國人群罹患冠心病的主要風險因素(表1)。

2.2 miR-26a-1 rs7372209(C＞T)基因型的分布及Hardy-Weinberg平衡檢驗 在所調查的人群中可檢出rs7372209的3種基因型為CC型、CT型、TT型。純合子的LDR探針擴增測序圖譜為單峰，雜合子的測序圖譜為雙峰，見圖1。采用雙盲法隨機抽取10%正常對照和冠心病標本進行PCR-LDR重復驗證，結果顯示測序結果100%一致。miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態的基因型分布頻率在華南地區對照人群中分別為57.2%(CC)、37.5%(CT)和5.3%(TT)。Goodness-of-fitχ2檢驗表明miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態位點在對照組中符合Hardy-Weinberg平衡(P=0.663)，表明本研究人群具有群體代表性，該人群的miR-26a-1 rs7372209基因型分布可反映整體人群基因型的分布情況。

2.3 miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態與冠心病遺傳易感的關系 CC、CT、TT基因型在冠心病組中的分布頻率分別為54.6%、37.6%和7.8%，在對照組中分別是57.2%、37.5%和5.3%，兩組間基因型頻率分布差異無統計學意義(χ2=1.554，P=0.460)。非條件邏輯回歸分析發現，以CC基因型作參照，CT基因型和TT基因型分別與其比較，均與冠心病易感無相關性(OR值分別為1.05和1.54，95%CI分別為0.75～1.49和0.78～3.06)。等位基因分析結果也顯示，攜帶 miR-26a-1 rs7372209 T變異等位基因與冠心病的遺傳易感無明顯相關(OR=1.5，95%CI=0.88 ～1.49，P=0.315)。此外，對年齡、性別、吸煙和冠心病史進行分層分析，均未發現有意義的結果。

圖1 m iR-26a-1 rs7372209 C＞T多態LDR分型結果圖

表1 冠心病組和對照組人群的臨床特征分析(±s)

表1 冠心病組和對照組人群的臨床特征分析(±s)

臨床資料 對照組(n=283)冠心病組(n=295)P值62.59±12.89 65.13±11.86 0.014性別〔n(%)〕 男 170(60.1) 195(66.1) 0.133女 113(39.9) 100(33.9)吸煙〔n(%)〕 無 198(70.0) 111(37.6) ＜0.001有 85(30.0) 184(62.4)喝酒〔n(%)〕 無 264(93.3) 210(71.2) ＜0.001有 19(6.7) 85(28.8)收縮壓(mmHg) 137.25±14.90 144.96±15.53 ＜0.001舒張壓(mmHg) 73.99±8.35 78.79±8.28 ＜0.001 FPG(mmol/L) 5.82±1.05 6.65±1.23 ＜0.001 TG(mmol/L) 1.48±0.71 2.19±1.07 ＜0.001 TC(mmol/L) 4.59±1.14 4.87±1.21 0.002 LDL-C(mmol/L) 2.75±0.77 3.09±0.82 ＜0.001 HDL-C(mmol/L) 1.21±0.32 1.25±0.37 0.159冠心病家族史〔n(%)〕無 280(98.9) 235(79.7) ＜0.001有 3(1.1) 60(20.3)年齡(歲)

3 討論

越來越多的研究表明，包括SNPs在內的遺傳因素在冠心病的發生發展過程中發揮重要作用，而miRNAs在心臟發育，心肌肥厚，心律失常，血管生成，血管內膜損傷及動脈粥樣硬化斑塊形成和不穩定等過程中發揮重要的作用〔6，7〕。本文提示miRNAs的基因多態性可能與冠心病的遺傳易感性密切相關。

有研究表明，miR-26a-1 rs7372209多態位點在非小細胞肺癌，結腸癌，膀胱癌和口腔黏膜癌前病變的發生過程中發揮重要角色，例如，miR-26a-1 rs7372209多態位點可使女性膀胱癌的發病風險降低64%〔4〕，但使口腔黏膜癌前病變的發病風險升高2倍〔5〕。研究提示miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態與華南地區冠心病的發生沒有相關性。此外，對年齡、性別、吸煙和冠心病史進行分層分析，也均未發現有意義的結果，該結果進一步說明miR-26a-1 rs7372209(C＞T)多態與這些冠心病發生的重要因素無關，這也可能是它不影響個體患冠心病發病風險的原因之一。冠心病是多因素疾病，不同遺傳背景和不同的環境危險因素對冠心病的發生有著重要的影響。因此，對于miR-26a-1 rs7372209(C＞T)基因多態性與冠心病的關系，仍需要在不同人種、不同的民族和不同的環境危險因素的作用下，探討該多態位點對冠心病發病風險的影響。

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Relationship between m iR-26a-1 rs7372209 polymorphism and the genetic susceptibility of coronary artery disease

CHENG Jie，CEN Jin-M ing，YANG Xi-Li，et al.
Institute of Aging Research，Guangdong M edical College，Dongguan 523808，Guangdong，China

ObjectiveTo investigate the distribution ofgenotypes and alleles ofmiR-26a-1 rs7372209 polymorphism，and the correlation between this polymorphism and the genetic susceptibility of coronary artery disease(CAD)in the Han nationality of Southern China.MethodsThe genotypes of themiR-26a-1 rs7372209(C＞T)polymorphism were determined in 295 CAD patients and 283 control blood donors by polymerase chain reaction-ligase detection reaction(PCR-LDR).Association between the polymorphism and the risk for CAD was evaluated using unconditional logistic regression analysis.ResultsThe frequency of CC，CT and TT genotypes in the case subjects were 54.6%，37.6%and 7.8%respectively and in the control subjectswere57.2%，37.5%and 5.3%.No significantdifferencewas observed in the frequency ofmiR-26a-1 genotypes between cases and controls(χ2=1.554，P=0.460).Moreover，no significantly increased risk for CAD was observed for those carrying T variant allele(OR =1.15，95%CI=0.88 ～ 1.49，P=0.315).ConclusionsmiR-26a-1 rs7372209(C＞T)polymorphism is not associated with CAD in the Han nationality of Southern China.

miR-26a-1;Single nucleotide polymorphism;Coronary artery disease;Genetic susceptibility

R349.3

A

1005-9202(2013)12-2737-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.001

國家自然科學基金(No.81000143，81170327);廣東省自然科學基金(No.S2011010002922);東莞市科技計劃醫療衛生類重點項目(No.2011105102007);廣東省衛生廳科研基金(No.A2011431，B2009191);廣東醫學院科技創新基金(No.STIF201102)

1 廣東醫學院生物化學與分子生物學教研室

2 佛山市第一人民醫院 3 廣東省醫學分子診斷重點實驗室

熊興東(1978-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事衰老及老年性疾病的分子機制研究。

成 捷(1988-)，女，在讀碩士，主要從事衰老及老年性疾病的分子機制研究。

〔2012-09-19收稿 2013-01-12修回〕

(編輯 曹夢園)