5－HT6受體在血管性癡呆大鼠海馬中的表達變化

陳小東 李 園園 劉 雁 (廣州醫科大學研究生院，廣東 廣 州 5 082)

腦血管病，尤其是腦卒中后慢性腦缺血被認為是血管性癡呆(VD)的最常見病因，其病理生理機制涉及缺血后繼發的腦能量代謝障礙、炎癥因子的瀑布效應、氧化應激損傷、興奮性氨基酸毒性作用、膽堿能神經元功能缺失等〔1〕。5-羥色胺(5-HT)受體家族在中樞神經系統認知、情感、攝食、晝夜周期等生理活動中具有調節作用〔2〕，其中，5-HT6受體幾乎僅分布在中樞神經系統，尤其以紋狀體、皮層、邊緣系統等腦區的分布密度高，已被證實參與大腦學習、記憶、情感等高級智能和精神活動〔3〕。本文采用大鼠永久性雙側頸總動脈阻斷模型，觀察腦缺血后海馬病理變化及CA1區5-HT6表達的改變，探討該受體與VD發病的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康SPF級Wistar大鼠80只，購自南方醫科大學動物實驗中心，體重200～250 g，雌雄比例為1∶1，所有實驗大鼠飼養于廣州軍區廣州總醫院動物中心，飼養房內溫度(22 ±3)℃，濕度60%，5 只/籠，光/暗周期為12 h/12 h，實驗期間自由獲取水及標準顆粒飼料。

1.1.2 主要試劑 兔抗鼠5-HT6受體多克隆抗體購自Abcam公司，Envision二步法檢測試劑盒購自Dako公司，二氨基聯苯胺(DAB)試劑購自福州邁新生物公司，其余化學試劑均為分析純級。

1.1.3 主要儀器 Morris大鼠水迷宮，SuperMaze動物行為學視頻分析系統(上海欣軟信息科技)，日本Olympus BX-51顯微鏡，ImagePro plus病理圖文分析系統。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制作 所有大鼠適應性飼養1 w后隨機分成兩組，VD組50只，假手術組(SO組)30只。動物術前禁食、禁水4 h，稱重后以10%水合氯醛按350 mg/kg體重腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定后常規消毒頸部手術區域，在頸前正中作一長約1 cm的縱形切口，鈍性分離皮下軟組織、頸前肌群，在氣管的側后方找到頸動脈鞘，分離頸總動脈與迷走神經，以1號絲線永久性結扎頸總動脈，同法結扎另一側頸總動脈，局部消毒后恢復組織層次并縫合皮膚。SO組大鼠除不結扎雙側頸總動脈外，其余操作與VD組大鼠一致。術后動物另放于干凈鼠籠飼養，自由獲取水源及飼料。

1.2.2 動物行為學觀察(Morris水迷宮實驗) 大鼠Morris水迷宮為一內徑160 cm、高50 cm的圓形水池，水池內壁被漆成黑色，池壁上黏貼不同形狀的空間標記物，一個直徑為12 cm的逃生平臺固定于水池中的某一象限(即目標象限)，進水后水面高出平臺約1 cm，水池上方橫架安裝連接計算機顯示系統的攝像儀。

SO組和VD組大鼠分別在雙側頸總動脈阻斷術后4、8 w進行 Morris水迷宮實驗，第 1 ～4 天(即 trial 1、trial 2、trial 3、trial 4)將大鼠從四個不同象限面向水池壁放入水中，大鼠找到逃生平臺后終止信息采集，最長采集時間為120 s，若超過120 s大鼠仍未能找到平臺，則將其引導至逃生平臺并在平臺上站立20 s以使其形成對空間參照物的記憶，每只大鼠如此訓練4次/d，每次訓練之間有15 s間歇以便休息，連續訓練4 d，記錄大鼠找到平臺的逃避潛伏期評估其空間學習能力;第5天將逃生平臺從水池中撤去，將大鼠從四個不同象限投入水中，記錄60 s內大鼠在目標象限搜尋的時間，以此評估大鼠的空間記憶能力。每天固定在8:00～17:00進行水迷宮實驗，實驗過程中保持房間內光照恒定并且無光線直射于水面，水溫控制在26℃左右，迷宮外參照物保持不變。

1.2.3 組織標本固定、制片、染色 每組各取5～6只大鼠分別在術后的相應觀察終點麻醉動物，以4℃預冷4%多聚甲醛溶液經心臟灌注固定，斷頭取腦后從視交叉后2～3 mm處冠狀位切取厚度約3 mm的腦組織，放入10%中性甲醛溶液中固定24 h。在自動脫水機中梯度酒精脫水、透明、浸蠟后包埋，蠟塊組織作連續冠狀切片，厚度2～3 μm。石蠟切片脫蠟、水化后分別進行蘇木素-伊紅(HE)染色和Nissl染色，在光學顯微鏡高倍鏡(×400)下觀察海馬CA1區錐體細胞計數及形態。

1.2.4 免疫組化顯色分析海馬CA1區5-HT6受體的分布與表達 石蠟切片經脫蠟、水化，置于pH6.0的檸檬酸鹽中高壓修復;0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，3%過氧化氫溶液避光孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，切片滴加兔抗鼠5-HT6受體多克隆抗體(1∶1 000稀釋)，置于濕盒內 4℃冰箱中過夜孵育;次晨取出切片0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，滴加葡聚糖復合物(二抗)，室溫下孵育40 min，0.01 mol/L PBS沖洗5 min×3次，滴加DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色合適后流水沖洗終止反應，梯度酒精脫水、TO生物透明劑透明，中性樹膠封片后鏡檢觀察。

1.3 統計學方法 應用SPSS13.0軟件進行分析，計量資料采用±s表示，兩組獨立樣本均數比較采用t檢驗，多個樣本均數比較進行Levene方差齊性檢驗，方差齊采用單向方差分析，方差不齊采用Brown-Forsythe法;平均逃避潛伏期和平均游泳速度在滿足Mauchly球對稱檢驗時采用單個重復測量因素的方差分析，不滿足Mauchly球對稱檢驗經Huynh-Feldt系數校正自由度。

2 結果

2.1 大鼠Morris水迷宮結果 術后4、8 w，SO組和VD組大鼠在定位航行試驗中的平均游泳速度均無明顯統計學差異(P＞0.05)。術后4 w和8 w，VD組大鼠與同時間點SO組大鼠平均逃避潛伏期比較均明顯延長(P＜0.001)，提示VD組大鼠在術后無明顯運動功能障礙，但存在空間學習能力減退，而且學習能力下降隨腦缺血時間延長加重。術后4 w空間探索試驗中，SO組和VD組大鼠目標象限的平均搜尋時間比較具有統計學差異(P＜0.001)，提示VD組大鼠空間記憶能力下降。見表 1，表 2，圖 1。

表1 假手術組和血管性癡呆組大鼠在術后4 w和8 w定位航行試驗的平均游泳速度比較(±s ，mm/s)

表1 假手術組和血管性癡呆組大鼠在術后4 w和8 w定位航行試驗的平均游泳速度比較(±s ，mm/s)

組別 Trial 1 Trial 2 Trial 3 Trial 4四次訓練的均值SO 4 w 239.15±56.21 237.46±48.99 344.49±74.95207.85±56.31 257.24±20.92 SO 8 w 241.34±55.59 235.57±44.47 348.11±68.62 201.83±60.22 256.72±17.99 VD 4 w 264.59±93.47 269.10±65.76 232.46±59.27 201.88±32.81 242.01±26.26 VD 8 w 274.35±94.30 215.28±40.59 183.83±38.47182.42±41.01 230.69±37.96

表2 假手術組和血管性癡呆組大鼠在術后4 w和8 w定位航行試驗的平均逃避潛伏期比較(±s，s)

表2 假手術組和血管性癡呆組大鼠在術后4 w和8 w定位航行試驗的平均逃避潛伏期比較(±s，s)

與SO組同時間點比較:1)P＜0.05

組別 Trial 1 Trial 2 Trial 3 Trial 4四次訓練的均值SO 4 w 95.41±9.94 42.41±17.81 30.06±6.42 26.58±12.78 48.62±7.99 SO 8 w 68.09±45.91 29.00±15.53 27.05±8.88 21.36±15.95 30.38±17.08 VD 4 w 99.91±11.91 89.98±8.91 85.55±18.38 75.31±8.73 87.69±7.341)VD 8 w 108.79±18.91 106.11±11.88 102.07±19.44 98.09±23.69 103.77±11.181)

2.2 VD大鼠海馬CA1區組織病理學改變 HE染色后在高倍鏡(×400)下，假手術組大鼠海馬CA1區神經元排列整齊、緊密，胞膜完整，胞核清楚;術后2 d VD組海馬CA1區未見明顯的病理變化，錐體細胞數量略減少;術后1 w VD組海馬CA1區神經元排列基本正常，但錐體神經元數量減少;術后4 w VD組CA1區神經元排列稀疏、紊亂，錐體細胞變性壞死、數量明顯減少，胞核固縮，胞漿嗜酸性;術后8 w VaD組海馬病理改變進一步加重，神經元細胞空泡化，錐體細胞基本消失。見圖2。

尼氏染色后在高倍鏡(×400)下，假手術組大鼠海馬CA1區錐體神經元胞質中尼氏體豐富呈斑片狀;術后2 d VD組大鼠海馬CA1區錐體神經元形態結構基本正常，神經元尼氏體未見減少;術后1 w VD組海馬CA1區錐體神經元空泡化改變，胞漿內尼氏體減少;術后4 w，VaD組海馬CA1區錐體神經元固縮，細胞數明顯減少;術后8 w，VD組海馬CA1區錐體神經元排列稀疏、紊亂，胞漿中尼氏體顯著減少。見圖3，圖4。

2.3 免疫組化分析海馬CA1區神經元5-HT6受體表達變化與假手術組大鼠比較，VD組大鼠海馬CA1區神經元5-HT6受體在術后2 d無明顯變化，術后1 w表達略減少，在術后4～8 w亞組中表達明顯減少(P＜0.001)。見圖5，表3。

圖1 兩組大鼠在目標象限的平均搜尋時間比較

圖2 海馬CA1區HE染色(×400)

圖3 海馬CA1區尼氏染色(×400)

表3 兩組大鼠海馬CA1區神經元免疫組化5-HT6受體平均光密度分析(±s)

表3 兩組大鼠海馬CA1區神經元免疫組化5-HT6受體平均光密度分析(±s)

與術后同時間SO組比較:1)P＜0.001

組別 SO組 VD組術后2 d 246.14±38.90 240.87±76.09術后1 w 234.59±47.31 220.53±96.34術后4 w 244.61±32.91 122.96±11.911)術后8 w 243.82±31.45 83.97±7.121)

圖4 兩組大鼠海馬CA1區錐體神經元計數

圖5 免疫組化檢測海馬CA1區神經元5-HT6受體平均光密度

3 討論

VD是各種腦血管因素相關病因所致腦血流循環障礙并引起與認知相關腦區神經元退行性改變、全腦功能退化的神經退行性疾病。本文采用大鼠雙側頸總動脈阻斷模型模擬人類因慢性腦缺血、全腦低灌注所致的VD，該模型引起典型的皮層缺血性改變和皮層下白質病變，包括白質疏松化、脫髓鞘、膠質增生等，與人類老齡化或腦卒中后癡呆的神經病理改變相似，是VD的經典動物模型〔4〕。Farkas等〔5〕指出大鼠永久性雙側頸總動脈阻斷模型術后腦血流的減少是有選擇性的，以皮層和白質腦血流下降最為明顯，僅為正常大鼠的35% ～45%，海馬腦血流下降到正常大鼠的60%左右，術后1 w腦血流開始恢復，但4 w以后腦血流仍明顯低于正常對照的動物，術后8～12 w腦血流基本恢復到正常水平。本實驗觀察發現缺血急性期海馬損傷并不十分明顯，術后1～2 w可以在海馬觀察到CA1區錐體神經元丟失、膠質細胞激活，并且這種缺血性損害隨著腦缺血狀態的持續而進行性加重，術后4 w海馬CA1區錐體神經元明顯減少，神經元空泡樣變性，術后8 w海馬病變呈毀滅性，錐體細胞顯著減少，這與文獻報道的結果一致〔6〕。雖然慢性缺血過程中腦血流通過側支循環重建等各種代償機制使全腦血流在8～12 w后逐漸恢復到正常水平，但低灌注對海馬造成的缺血性損害是不可逆的。實驗中術后8 w VD組大鼠在定位航行試驗中逃避潛伏期較假手術對照組明顯延長，空間探索試驗中在目標象限的搜尋時間亦較假手術組減少，均提示海馬缺血性損傷對VD大鼠造成的空間學習、記憶能力減退的影響。一方面，海馬作為腦內參與學習、記憶等高級智能活動的重要腦區，因其特殊的供血結構而對缺血極為敏感，另一方面，錐體神經元長時程增強(LTP)是記憶形成的重要神經生理基礎，推測海馬慢性缺血性損傷、錐體神經元丟失參與了VD的發病機制。

目前，已發現5-HT受體家族包括七種分型(5-HT1～7R)，5-HT1A、5-HT4和5-HT6受體是在多項動物實驗研究中被發現與中樞神經系統認知、學習、記憶等思維活動密切相關的受體亞型〔7〕，其中，5-HT6受體幾乎僅分布于中樞神經系統，而且其所分布的腦區均與人類的認知、學習、記憶、情感等功能相關，在腦內與乙酰膽堿、谷氨酸、γ-氨基丁酸、腎上腺素、去甲腎上腺素等多種參與學習、記憶、情感、認知過程的神經遞質均有相互作用〔3〕。在與學習、記憶密切相關的海馬，5-HT6受體主要分布在CA1區神經元突觸后膜上?；陔p側頸總動脈阻斷后腦血流的動態改變及海馬缺血性損傷的時間特點，實驗中選擇了術后2 d、1 w、4 w、8 w作為5-HT6受體表達水平的觀察時間點。行為學觀察結果證實VD大鼠存在明顯空間學習、記憶能力缺失，且這種學習、記憶能力的減退隨腦缺血時間延長加重。結合免疫組化結果分析，VD大鼠海馬CA1區神經元上5-HT6受體的表達在腦缺血術后1 w開始下降，以術后4～8 w受體表達下調最為顯著，5-HT6受體表達的下調與動物學習、記憶功能下降的時間基本一致?；贛orris水迷宮是海馬依賴性的行為學檢測方法，因此推測VD大鼠空間學習、記憶能力減退與神經元5-HT6受體表達改變相關。一方面，考慮到慢性缺血對海馬所造成的組織病理學改變，尤其是錐體神經元的變性壞死、丟失，可能導致受體蛋白表達、合成減少;另一方面，國外研究證實拮抗5-HT6受體可以促進腦內乙酰膽堿釋放〔8，9〕，后者是記憶形成與維持的重要神經遞質，而且動物行為學研究發現5-HT6受體拮抗劑能提高學習、記憶、改善認知功能〔10〕并可以逆轉由抗膽堿能藥物(如東莨菪堿)所致的記憶缺損，因此，可以推測慢性腦缺血后期5-HT6受體表達下調可能是中樞神經對抗缺血性損傷的一種保護機制，通過受體表達下調重新調節神經信息網絡中其他神經遞質，如乙酰膽堿、谷氨酸等的水平，從而提高中樞神經對缺血性腦損傷后認知功能障礙的耐受性。

綜上所述，海馬是高等動物學習、記憶過程中重要的信息整合中樞，5-HT6受體表達于海馬CA1區神經元，拮抗該受體可以提高海馬中乙酰膽堿的水平，在發生慢性腦缺血后上述區域該受體表達隨缺血進展而減少可能是中樞神經信息網絡重構的一種代償機制。

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