阿托伐他汀對糖尿病大鼠視網膜核因子－κB表達的影響

魏 薇 于曉靜 王曉梅 隋 淼 朱瑞萍 李 湘

(大連大學附屬中山醫院內分泌科，遼寧 大連 116001)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病(DM)常見和嚴重的慢性并發癥之一，是DM患者的主要致盲原因。病程20年以上的DM患者中，幾乎全部的1型DM患者及60%的2型DM患者均可出現程度不同的視網膜病變〔1〕。核因子(NF)-κB作為一個具有多向性調節作用的核轉錄因子，對眾多調節血管病變的細胞因子、黏附因子等均有調控作用，被視為DM微血管病變的中心調節因子〔2〕。隨著對DR的深入研究，許多學者發現，NF-κB 在 DR 的發生、發展中起著重要作用〔3，4〕。阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑家族成員之一，近年發現，他汀類藥物除了降血脂作用外，同時具有抗炎作用〔5〕。NF-κB的激活在DR的發生中起著重要作用。而阿托伐他汀是否可以通過抑制DM大鼠視網膜NF-κB的活性來改善DR，尚不清楚。本研究目的在于探討阿托伐他汀對DM大鼠視網膜NF-κB的表達影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型復制 健康8周齡雄性SD大鼠60只，體重200～350 g，購于大連醫科大學實驗動物中心。隨機抽取20只做正常對照組，其余大鼠以鏈脲左菌素65 mg/kg〔6〕的劑量進行一次進行腹腔注射。注射后72 h，常規消毒后，取尾靜脈血少量，測量血糖，以血糖高于16.7 mmol/L〔7〕作為DM模型成功標準。成模的38只大鼠隨機分成兩組，即DM非藥物干預組及DM阿托伐他汀干預組。阿托伐他汀干預組于成模后48 h，將阿托伐他汀溶于飲用水，按照每只大鼠體重2 mg·kg－1·d－1灌胃，糖尿病非藥物干預組及正常對照組每天給予等量飲用水灌胃，共計24 w。分別于3個月和6個月藥物治療后，將3組大鼠各取8只取大鼠雙眼，一只用10%中性甲醛固定制備病理切片，另一只置于－80℃冰箱用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測NF-κB mRNA 半定量RT-PCR檢測NF-κB mRNA的表達:大連寶生物公司進行引物設計，NF-κB上游引物5'-CACCAAAGACCCACCTCACC-3'，下游引物5'-CCGCATTCAAGTATAGTCCC-3'(產物260 bp)。內參β-actin上游引物5'-CACACGCAGCTCATTG-3'，下游引物5'-AAGGACTCCTACGTTG-3'(產物141 bp)。用Trizol提取總RNA。PCR總反應體系25 μl，反應條件 NF-κB:94℃初變性 2 min，進入循環，94℃變性30 s，59℃ 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，35 個循環后，72℃ 延伸10 min。β-actin:94℃初變性 2 min，進入循環，94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，35 個循環后，72℃ 延伸 10 min。PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察，掃描及半定量分析。

1.2.2 免疫組化方法檢測 NF-κB表達:SABC法測定，DAB顯色。檢測方法嚴格按照說明書操作。顯微鏡下控制顯色，陽性表達信號為棕黃色。PBS代替一抗做陰性對照。每個標本隨機選取3張切片，每張切片隨機選取3個200倍數高倍視野，細胞核棕黃著染者為陽性。計數標本的陽性細胞核數量的均值為結果，進行統計學分析。

1.3 統計學處理數據 采用SPSS17.0進行統計分析，數據以x±s表示。多組間均數的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 大鼠一般情況 按照STZ 65 mg/kg進行腹腔注射。3 d后大鼠情況為:(1)大鼠生長情況:注射后的第1天死亡2只，第3天死亡1只，第5天死亡1只。(2)STZ大鼠與正常大鼠的外觀相比，精神萎靡，行動遲緩，皮毛潮濕，墊料潮濕。36只大鼠血糖＞16.7 mmol/L，造模成功。血糖＜16.7 mmol/L的2只大鼠，待血糖恢復后，重新給予STZ 65 mg/kg一次性腹腔注射。各組大鼠血糖情況見表1。

2.2 RT-PCR法檢測NF-κB的表達 見表2及圖1。

2.3 免疫組化結果 顯微鏡下觀察:在正常對照組3個月及正常對照組6個月，NF-κBp65在視網膜血管層有少許表達，在光鏡下胞核呈棕黃色。DM組3個月與正常組3個月相比NF-κBp65陽性細胞數量在視網膜血管層表達增加，顏色加深呈深棕色。阿托伐他汀組3個月細胞數量較DM組3個月明顯減少顏色也較其淺，但數量較正常組3個月多顏色較其深。DM6個月時，NF-κBp65陽性細胞數量在視網膜血管層表達最多，在節細胞層也有表達，顏色較DM 3個月組深。阿托伐他汀組6個月組細胞數量較DM 6個月組明顯減少顏色也較其淺。見表2及圖2。

表1 不同時期各組大鼠的血糖平均值(x ± s，mmol/L)

表2 各組大鼠視網膜NF-κB mRNA的表達比值(x ± s，n=8)

圖1 PCR法檢測NF-κB mRNA表達

圖2 免疫組化圖(DAB，×200)

3 討論

DR是DM的眼部并發癥之一，周細胞的選擇性喪失是DR最早的病理改變。Romeo等〔8〕檢測DM患者血管內凋亡的周細胞之后，發現激活的NF-κB在絕大多數凋亡的細胞內都可檢測出來。NF-κB的激活是周細胞發生凋亡的信號通路的觸發點，在DR的發生中起著重要作用。因此，通過藥物干預的方式使NF-κB激活的各個環節受到抑制，是預防和治療DR病變的一個重要的研究方向。

3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制劑或他汀類，是膽固醇生成的強有力抑制劑，廣泛用于治療高脂血癥〔9〕。近年發現，他汀類藥物除了降血脂作用外，同時具有抗炎作用。目前已經認識到慢性炎癥在動脈粥樣硬化中發揮重要作用〔10〕。Bustons等〔11〕建立了家兔股動脈粥樣硬化的動物模型，經4 w的阿托伐他汀治療，治療組家兔的血脂水平及病灶大小較非治療組明顯降低和縮小，動脈中的巨噬細胞浸潤幾乎被清除，NF-κB表達明顯下調。最近的研究發現，DM患者應用阿托伐他汀治療后可以提高其內皮的穩定性〔12〕。有學者認為他汀類藥物抑制NF-κB活化的可能機制是他汀類藥物抑制了p21ras途徑的DNA合成過程〔13，14〕。干擾了ras介導的細胞信號轉導，最終導致NF-κB活化受到抑制。

本研究說明在大鼠眼球中，NF-κB除在視網膜組織有表達外，在其他的組織也有表達。由于視網膜組織很薄，在制作標本過程中，染色很難操作，有的部位視網膜結構不是很完整，可能是取材固定所致，未必是DM所致的結構改變。本研究證實阿托伐他汀可以通過抑制NF-κB表達減輕DM大鼠視網膜組織的炎癥反應，由于沒有設置不同的阿托伐他汀劑量組，尚不能證實哪種劑量更安全有效。

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4 Zheng L，Szabo C，Kern TS.Poly(ADP-ribose)polymerase is involved in the development of diabetic retinopathy viaregulation of nuclear factor-KB〔J〕.Dia betes，2004;53(11):2960-7.

5 Song Y，Li C.Fluvastatin prevents nephropathy likely through suppression of connective tissue growth factor-mediated extracellular matrix accumulation〔J〕.Exp Mol Pathol，2004;76(1):66-75.

6 Wei M，Ong L，Smith MT，et al.The streptozotocin-diabetic rat as a model of the chronic complication of human diabetes〔J〕.Heart，Lung Circulation，2003;12(1):44-50.

7 汪新蝤.醫學實驗動物學〔M〕.北京:人民軍醫出版社，2000:275-8.

8 Romeo G，Liu WH，Asnaghi V，et al.Activation of nuclear factor-kappa B induced by diabetes and high glucose regulates a proapoptotic program in retinal pericytes〔J〕.Diabetes，2002;51(7):2241-8.

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