ITPA基因變異與干擾素聯(lián)合利巴韋林治療過(guò)程中發(fā)生貧血的相關(guān)性

王茉莉 潘 煜 姜 晶 遲秀梅 李婉玉 姜 濤 張 洪 牛俊奇

(長(zhǎng)春一汽總醫(yī)院 吉林大學(xué)第四醫(yī)院感染科，吉林 長(zhǎng)春 130011)

ITPA基因變異與干擾素聯(lián)合利巴韋林治療過(guò)程中發(fā)生貧血的相關(guān)性

王茉莉 潘 煜1姜 晶1遲秀梅1李婉玉1姜 濤2張 洪1?？∑?

(長(zhǎng)春一汽總醫(yī)院 吉林大學(xué)第四醫(yī)院感染科，吉林 長(zhǎng)春 130011)

目的探討C20orf194基因rs6051702位點(diǎn)和ITPA基因rs1127354位點(diǎn)與慢性丙型肝炎治療過(guò)程中利巴韋林引起的溶血性貧血之間的相關(guān)性。方法入選慢性丙型肝炎患者742例、健康人群203例，提取上述兩組人群的基因組DNA進(jìn)行兩個(gè)位點(diǎn)的焦磷酸測(cè)序;對(duì)208名慢性丙型肝炎患者進(jìn)行干擾素聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療，并在抗病毒治療的基線、2 w、4 w、12 w對(duì)患者進(jìn)行血常規(guī)、HCV RNA定量檢測(cè)。用SAS9.0軟件進(jìn)行分析。結(jié)果(1)我國(guó)健康人群rs6051702及rs1127354位點(diǎn)的最小等位基因頻率分別為15.3%、15.8%，與歐洲和日本接近，但水平略低。(2)2、4、12 w血紅蛋白下降量與rs1127354位點(diǎn)的不同基因型的關(guān)系有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，A等位基因具有保護(hù)作用。(3)2、4、12 w血紅蛋白下降量與rs6051702位點(diǎn)的不同基因型的關(guān)系無(wú)顯著差異(均P＞0.05)。(4)rs1127354位點(diǎn)4 w血紅蛋白降低超過(guò)3 g/dl的CC組與AC+AA組存在差別(P=0.001)。結(jié)論(1)rs6051702位點(diǎn)、rs1127354位點(diǎn)在慢性HCV感染者、健康人群之間沒(méi)有顯著差異。(2)rs6051702位點(diǎn)與抗HCV治療過(guò)程中血紅蛋白下降量無(wú)相關(guān)性。(3)ITPA基因rs1127354位點(diǎn)與抗HCV治療過(guò)程中血紅蛋白下降量呈明顯相關(guān)，含A等位基因(AC和AA型)的患者貧血程度較CC型的低，提示A等位基因?yàn)楸Ｗo(hù)基因，可用來(lái)預(yù)測(cè)患者抗HCV治療過(guò)程中血紅蛋白下降的程度，并指導(dǎo)早期調(diào)整利巴韋林劑量。

慢性丙型肝炎;利巴韋林;溶血性貧血;單核苷酸多態(tài)性;ITPA基因

近期有研究表明，在歐裔美國(guó)人、美國(guó)黑人和白人慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染者中第20號(hào)染色體上C20orf194基因的rs6051702位點(diǎn)和三磷酸肌苷焦磷酸酶(ITPA)基因中的rs1127354位點(diǎn)的變異直接與利巴韋林治療慢性丙型肝炎病人4 w時(shí)血紅蛋白(HGB)下降程度密切相關(guān)〔1，2〕。日本的兩個(gè)研究證實(shí)在日本人群中ITPA基因遺傳變異能夠保護(hù)性抑制利巴韋林引起的溶血性貧血，其中rs1127354位點(diǎn)被確認(rèn)為利巴韋林治療誘發(fā)溶血性貧血的最有效的預(yù)測(cè)因子，A等位基因?yàn)楸Ｗo(hù)性基因，同時(shí)發(fā)現(xiàn)C20orf194基因的rs6051702位點(diǎn)和利巴韋林治療后HGB水平降低有關(guān)〔3，4〕。目前國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有關(guān)于ITPA基因與干擾素(INF)聯(lián)合利巴韋林治療中貧血發(fā)生關(guān)系的報(bào)道。本研究擬明確我國(guó)北方人群中C20orf194基因和ITPA基因的等位基因頻率及基因型分布，探討C20orf194基因和ITPA基因多態(tài)性位點(diǎn)與慢性丙型肝炎治療過(guò)程中利巴韋林引起的溶血性貧血之間的相關(guān)性，找到利巴韋林治療引起溶血性貧血的預(yù)測(cè)因子。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 慢性丙型肝炎患者742例，來(lái)自丙型肝炎流行地區(qū)。健康人群203人。對(duì)742名慢性丙型肝炎患者進(jìn)一步檢查，有208例患者簽寫(xiě)知情同意書(shū)后進(jìn)行INF聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療。治療方案為INF-α500萬(wàn)U隔日一次皮下注射、利巴韋林900 mg每日口服，并在抗病毒治療的基線、2 w、4 w進(jìn)行血常規(guī)、HCV RNA定量檢測(cè)。其中有50例因不能保持較好的依從性，實(shí)際服用劑量低于治療劑量的80%，從本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中篩除，余158例患者最后進(jìn)入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。其中男106例(67.1%)，年齡49(45～56)歲，基線體重65(58 ～70)kg，體重指數(shù)22.6(21.1～24.8)kg/m2，HGB 15.5(13.6 ～16.0)g/dl，血小板(PLT)167(132～200)×109/L，白細(xì)胞(WBC)5.70(4.7～6.8)×109/L，中性粒細(xì)胞3.4(2.6～4.0)×109/L，紅細(xì)胞4.8(4.4～5.2)×1012/L，HCV RNA 6.3(5.4～6.7)log轉(zhuǎn)換。

慢性丙型肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)及治療適應(yīng)證均根據(jù)2004年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)制定的《丙肝防治指南》中的規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器 離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物有限公司);全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清生物科技有限公司);Roche COBAS?AmpliPrep?/TaqMan?全自動(dòng)熒光定量PCR儀(美國(guó));ABI7300熒光定量PCR儀(ABI公司);HCV RNA檢測(cè)試劑盒(羅氏分子系統(tǒng)，美國(guó));血球分析儀BCC-3000B(長(zhǎng)春迪瑞實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3 基因組DNA的提取 采用離心柱方法提取全血基因組DNA，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用全自動(dòng)凝膠成像分析儀分析DNA含量，從NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)數(shù)據(jù)庫(kù)中查到SNP rs6051702的序列:AACTCACCATATAACAGGGGTTATTC〔A/C〕TTATATCCTCAAAGAGTGCACTGCC;SNP rs1127354的序列:TCGTTCAGATTCTAGGAGATAAGTTT〔A/C〕CATGCACTTTGGTGGCACAGAAAAT，利用焦磷酸測(cè)序的方法對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 血常規(guī)檢測(cè) 采集外周抗凝血2 m l，應(yīng)用血球分析儀進(jìn)行三分類(lèi)檢測(cè)，檢查項(xiàng)目包括白細(xì)胞、紅細(xì)胞、HGB、血小板等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SAS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，使用χ2分析中的擬合優(yōu)度檢驗(yàn)進(jìn)行哈迪溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)(HWE)，利用χ2檢驗(yàn)、非參數(shù)秩和檢驗(yàn)、配對(duì)T檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。計(jì)量資料如若不符合正態(tài)分布，則以中位數(shù)(四分位區(qū)間)表示。

2 結(jié)果

2.1 SNP rs6051702等位基因頻率和基因型頻率 SNP rs6051702位點(diǎn)檢測(cè)基因型為AA、AC及CC三種。遺傳平衡檢驗(yàn)顯示，病例組與對(duì)照組均符合哈迪溫伯格遺傳平衡定律(P＞0.05)。慢性HCV感染人群和健康人群基因型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.497，P=0.17)，等位基因頻率比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.000 4，P=0.98)。見(jiàn)表 1。

表1 兩組SNP rs6051702基因型及基因頻率比較〔n(%)〕

2.2 SNP rs1127354等位基因頻率和基因型頻率 SNP rs1127354位點(diǎn)檢測(cè)基因型為CC、AC及AA三種。遺傳平衡檢驗(yàn)顯示，病例組與對(duì)照組均符合哈迪溫伯格遺傳平衡定律(P＞0.05)。慢性HCV感染人群和健康人群基因型(χ2=0.861，P=0.65)及等位基因頻率(χ2=0.328，P=0.57)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 兩組SNP rs1127354基因型及基因頻率比較〔n(%)〕

2.3 158例慢性丙型肝炎病人治療后HGB下降程度 對(duì)158名患者進(jìn)行2、4、12 w的回訪(分別有10、6、15人未參與相應(yīng)的回訪工作，其對(duì)應(yīng)的檢查結(jié)果缺失)，2、4、12 w HGB平均下降1.3(0.2～2.5)、1.7(0.8～3.0)、1.1(0 ～2.3)g/dl，嚴(yán)重貧血發(fā)生率分別為 13/148(8.8%)、8/152(5.3%)、4/143(2.8%)。

2.4 C20orf194基因rs6051702位點(diǎn)不同基因型與HGB下降的關(guān)系 158例患者 AA、AC、CC基因型分別為 113例(71.5%)、43例(27.2%)、2例(1.3%)。2 w時(shí)AA組HGB下降1.30 g/dl，AC+CC組 HGB降低1.45 g/dl;4 w時(shí) AA組HGB下降1.70 g/dl，AC+CC組降低1.45 g/dl;12 w時(shí)AA組HGB下降1.30 g/dl，AC+CC組降低0.85 g/dl。三個(gè)位點(diǎn)均P＞0.05，提示兩組無(wú)顯著差異，rs6051702位點(diǎn)不同基因型與HGB下降量沒(méi)有明顯的聯(lián)系。

2.5 ITPA基因rs1127354位點(diǎn)不同基因型與HGB下降的關(guān)系 158例患者CC、AC、AA基因型分別為133例(84.2%)、21例(13.3%)、4例(2.5%)。2 w時(shí)CC組HGB下降1.60 g/dl，AC+AA組HGB升高0.4 g/dl;4 w時(shí)CC組HGB下降2.00 g/dl，AC+AA組降低0.7 g/dl;12 w時(shí) CC組 HGB下降1.30 g/dl，AC+AA組降低0.6 g/dl。三個(gè)位點(diǎn)均 P＜0.05，提示不同基因型組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，含次要等位基因A的AC+AA組HGB下降量低，A等位基因具有保護(hù)性抑制貧血的作用。

2.6 4 w時(shí)兩個(gè)SNP位點(diǎn)不同基因分型HGB降低超過(guò)3 g/dl、嚴(yán)重貧血(HGB＜10 g/dl)的分析結(jié)果 C20orf194基因rs6051702位點(diǎn)HGB降低超過(guò)3 g/dl的AA組25例(22.7%)，AC+CC組14例(33.3%)，二者沒(méi)有差別(P=0.18);HGB水平低于 10 g/dl的 AA組 4例(3.6%)、AC+CC組 4例(9.5%)，二者沒(méi)有差別(P=0.14)。ITPA基因rs1127354位點(diǎn)HGB降低超過(guò)3 g/dl的CC組39例(30.5%)，AC+AA組0例，二者存在差別(P=0.002);HGB水平低于10 g/dl的AA組7例(5.5%)，AC+CC組1例(4.2%)，二者沒(méi)有差別(P=0.79)。

3 討論

歐美人rs6051702位點(diǎn)的最小等位基因頻率(MAF)19.4%、日本人MAF 19.9%，本研究與歐洲和日本接近，但水平略低。歐美人rs1127354位點(diǎn)的MAF為7.6%、日本人MAF為14.2%，本研究與日本近似，與歐美人差距相對(duì)大。

本研究結(jié)果顯示，C20orf194基因上的rs6051702位點(diǎn)與2、4、12 w HGB下降量無(wú)相關(guān)性，且不同基因型與HGB下降超過(guò)3 g/dl及嚴(yán)重貧血無(wú)相關(guān)性。而rs6051702位點(diǎn)在歐美人群中與4 w時(shí)HGB下降表現(xiàn)了顯著的相關(guān)性(P=1.1×10－45)〔1〕。日本Sakamoto等〔4〕的研究中，rs6051702位點(diǎn)與HGB下降量表現(xiàn)輕度的相關(guān)性〔odds ratio(OR)=1.40，P=9.0 ×10－3〕。這種差異可能是由于基因的連鎖不平衡(LD)在亞洲處于低水平所致。據(jù)報(bào)道，該C20orf194基因的rs6051702位點(diǎn)在不同種族之間與HGB降低的關(guān)系也存在差異，非洲裔人P=0.19，西班牙人 P=9.5 ×10－3〔1〕。

本研究通過(guò)非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ITPA基因上的rs1127354位點(diǎn)與2、4、12 w HGB下降量存在明顯相關(guān)性，提示rs1127354位點(diǎn)的遺傳變異與HGB下降量相關(guān)，AA+AC組平均HGB下降量低于CC組，提示rs1127354位點(diǎn)可用來(lái)預(yù)測(cè)患者接受利巴韋林治療后引起的溶血性貧血。而含有A等位基因的患者貧血出現(xiàn)的概率小，A等位基因?yàn)楸Ｗo(hù)性基因，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔1～4〕。

4 w時(shí)rs1127354位點(diǎn)的CC基因型中有69.5%的病人沒(méi)有出現(xiàn)明顯貧血，考慮可能存在其他一些低頻率的ITPA基因的SNP或細(xì)胞中存在其他酶類(lèi)對(duì)利巴韋林引起的溶血性貧血具有保護(hù)作用。其中中國(guó)北方慢性丙型肝炎rs1127354位點(diǎn)CC型病人抗病毒治療4 w時(shí)HGB降低超過(guò)3 g/dl的占30.5%，明顯低于歐美人的 48.4%〔1〕和日本人的48.7%〔4〕，原因考慮為:(1)樣本量相對(duì)小;(2)患者的依從性影響治療效果，且利巴韋林引起的溶血性貧血是劑量依賴(lài)的、可逆的，總體劑量的減少必然引起貧血出現(xiàn)概率降低;(3)不同種族及人群影響利巴韋林引起溶血性貧血的發(fā)生率。

本研究中的患者跟蹤到12 w，尚未涉及到24 w、48 w后治療結(jié)果的部分，沒(méi)有對(duì)SNP位點(diǎn)的遺傳變異與治療結(jié)果的關(guān)系進(jìn)行研究。在INF聯(lián)合利巴韋林抗病毒治療的過(guò)程中，病人保持良好的依從性是非常重要的，這樣可保持較好的治療應(yīng)答。在美國(guó)〔5〕和日本〔6〕的研究中證實(shí)增加利巴韋林用量可提高患者的持續(xù)病毒應(yīng)答(SVR)。Thompson等〔2〕的研究表明 ITPA遺傳變異與SVR存在明顯的相關(guān)性，而Sakamoto等〔4〕的研究中發(fā)現(xiàn)ITPA遺傳變異與抗病毒治療的效果的相關(guān)性不明顯，分析原因考慮與患者的年齡及肝臟纖維化程度的影響有關(guān)。這些有待在中國(guó)人群中進(jìn)一步檢驗(yàn)和認(rèn)證。

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2 Thompson AJ，F(xiàn)ellay J，Patel K，et al.Variants in the ITPA gene protect against ribavirin-induced hemolytic anemia and decrease the need for ribavirin dose reduction〔J〕.Gastroenterology，2010;139(4):1181-9.

3 Ochi H，Maekawa T，Abe H，et al.ITPA polymorphism affects ribavirininduced anemia and outcomes of therapy-A genome-wide study of Japanese HCV virus patients〔J〕.Gastroenterology，2010;139(4):1190-7.

4 Sakamoto N，Tanaka Y，Nakagawa M，et al.ITPA gene variant protects against anemia induced by pegylated interferon-a and ribavirin therapy for Japanese patientswith chronic hepatitis〔J〕.Hepatol Res，2010;40(11):1063-71.

5 McHutchison JG，Lawitz EJ，Shiffman ML，etal.Peginterferon alpha-2b or alfa-2a with ribavirin for treatment of hepatitis C infection〔J〕.N Engl J Med，2009;361(6):580-93.

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R512.63

A

1005-9202(2013)12-2759-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.011

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科 2 吉林省肝膽病醫(yī)院

?？∑?1958-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事病毒性肝炎研究。

王茉莉(1980-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事病毒性肝炎的分子生物學(xué)研究。

〔2012-10-11收稿 2013-01-02修回〕

(編輯 袁左鳴)