胰島素樣生長因子－1受體在小鼠毛細胞發(fā)育過程中的表達

陳 冬 賀 欣 宮 亮 李 里 (遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，遼寧 錦州 000)

胰島素樣生長因子－1受體在小鼠毛細胞發(fā)育過程中的表達

陳 冬 賀 欣1宮 亮 李 里2(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，遼寧 錦州 121000)

目的觀察在小鼠耳蝸毛細胞中胰島素樣生長因子(IGF)-1受體(IGF1R)分布和表達情況，探討其生物學特點。方法制作耳蝸組織鋪片，采用熒光免疫組織化學染色方法，激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠發(fā)育期間(出生后P0-P20)的IGF-1R在耳蝸毛細胞的分布和定位。應用Western印跡及實時PCR法檢測新生小鼠毛細胞在出生后不同時期IGF-1R蛋白及mRNA的表達水平。結(jié)果耳蝸組織鋪片熒光免疫組織化學染色方法顯示:IGF-1R在小鼠耳蝸發(fā)育過程中在毛細胞均有表達，部位在細胞膜上。隨著年齡的增加表達減少。Western印跡及實時PCR顯示小鼠耳蝸毛細胞的細胞膜蛋白及mRNA表達水平隨著出生年齡增加而逐漸減少。P0組和P4組，P12組，P20組細胞膜蛋白及mRNA的表達水平相比具有明顯差異(P＜0.05)，而P12和P20兩組間比較無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)論在小鼠耳蝸發(fā)育成熟過程中在耳蝸毛細胞IGF-1R均有表達，表達量隨著出生年齡增加而減少。推測在內(nèi)耳細胞發(fā)育增殖過程中起重要信號轉(zhuǎn)導作用。

胰島素樣生長因子受體;毛細胞;耳蝸

胰島素樣生長因子-1(IGF1)及其受體(IGF1R)促進細胞增殖并抑制凋亡，在組織器官及疾病發(fā)生發(fā)展中的作用是當前研究的熱點。IGF1的生物學功能由其表面的特異性靶細胞受體IGF1R介導，在耳蝸的成熟發(fā)育過程中及協(xié)調(diào)組織器官內(nèi)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。IGF1R在包括內(nèi)耳毛細胞及支持細胞生長發(fā)育中受多種生長因子調(diào)控。IGF-1R對動物聽覺感覺上皮和神經(jīng)元的發(fā)育、分化及存活可能有一定的調(diào)節(jié)作用。IGF-1R在耳蝸的生長發(fā)育中的研究至今仍無報道。近年來IGF-1R在防護腫瘤及神經(jīng)損傷方面應用廣泛〔1，2〕，但其在耳蝸發(fā)育中的變化仍無相關報道。本研究將檢測生長發(fā)育中的小鼠耳蝸IGF-1R的表達和定位分布特點，并探討其生物學特性及意義。

1 材料與方法

1.1 材料 TRIZOL(Invitrogene，CA，USA)，Cy5-AffiniPure山羊抗鼠 IgG，F(xiàn)cγ Subclass 1 Specific(Jackson，USA)，小鼠抗IGF-1R單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，實時PCR試劑盒(美國Qiagen公司)，圖像采集應用美國BioRad公司的Molecular Imager VersaDoc MP Systems。

1.2 免疫組織化學染色法觀察IGF-1R在耳蝸的表達 隨機選取在出生后4 d(P4)，8 d(P8)的新生小鼠，每組8只(16耳)，制作的耳蝸組織鋪片，滴加一抗IGF-1R(1∶500)，以及適當比例稀釋的羅丹明鬼筆環(huán)肽和神經(jīng)絲蛋白抗體(1∶100)，4℃過夜。PBS沖洗，5 min×3次。滴加熒光分子標記的混合二抗，兩者以1∶1的比例混合。然后在室溫下中孵育40 min，封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察IGF-1R在耳蝸毛細胞的分布和定位。

1.3 Western印跡法檢測IGF-1R蛋白表達 隨機選取4組在出生后不同時期0天(P0)，P4，12 d(P12)，20 d(P20)的新生小鼠，每組16只(32耳)，取小鼠耳蝸基底膜蛋白。Western印跡技術檢測耳蝸基底膜IGF-1R蛋白:將總蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后(每一樣本均含60μg總蛋白)，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，采用增強化學發(fā)光(ECL)檢測IGF-1R的表達。所用抗體為羊抗IGF-1R(Santa Cruz公司，稀釋度為1∶500)及辣根過氧化物酶標記的馬抗羊抗體(北京中山生物制品有限公司，稀釋度為1∶1 000)。用IGF-1R的灰度值表示IGF-1R的相對表達水平。

1.4 實時PCR檢測IGF-1R mRNA表達 隨機選取4組在出生后不同時期 P0，P4，P12，P20的新生小鼠，每組16只(32耳)，提取小鼠耳蝸基底膜組織總RNA。將提取的1μg總RNA擴增成DNA目的片段。反應循環(huán):95℃預變性5 min，94℃變性50 s，50℃退火 55 s，72℃延伸 1 min，40 個循環(huán)。4℃保存。IGF-1R引物序列參照文獻:上游引物:5'-GCT GAG CTG GTG GACGCT CT AG-3';下游引物:5'-AAT GTT TAC TTG TGT ATT TCA TTG-3';目的片段為208 bp;內(nèi)參β-actin上游引物:5'-CTCCTCTTGCTCGAAGTCTC-3';下游引物5'-TCGATGTCGAAGACCTTCAACA-3';目的片段為201 bp。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳、紫外分析儀觀察、照相，應用圖文分析系統(tǒng)進行分析，IGF-1R與β-actin的灰度比值表示IGF-1R的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包，組間差異比較用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 熒光免疫組化觀察IGF-1R小鼠耳蝸HC的表達 一抗、二抗孵育后，激光共聚焦顯微鏡下觀察，IGF-1R抗體結(jié)合部位發(fā)出綠色熒光。小鼠耳蝸HC細胞有IGF-1R表達，主要分布于細胞膜。IGF-1R在P0、P4、P12和P20小鼠耳蝸鋪片毛細胞中的表達量隨著出生年齡增加而逐漸減少。見圖1。

2.2 IGF-1R蛋白及mRNA在小鼠耳蝸HC的表達檢測 隨著出生年齡增加，小鼠耳蝸毛細胞的IGF-1R蛋白和mRNA表達水平逐漸減少。P0組和P4組，P12組，P20組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，P4組和P12組，P20組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 IGF-1R在不同出生年齡小鼠耳蝸鋪片HC中的分布狀態(tài)

表1 IGF-1R蛋白和mRNA在各組小鼠的耳蝸基底膜組織中的表達(±s，n=32)

表1 IGF-1R蛋白和mRNA在各組小鼠的耳蝸基底膜組織中的表達(±s，n=32)

與P0組比較，2)與P4組比較:均P＜0.05

組別 IGF-1R/β-actin IGF-1RmRNA/β 1.93±0.51 1.97±0.61 P4組 1.43±0.441) 1.59±0.761)P12組 0.54±0.211)2) 0.64±0.411)2)P20組 0.39±0.091)2) 0.58±0.221)2)-actin P0組

3 討論

IGF-1R和胰島素有同源性。其是一種酪氨酸蛋白受體，可以與IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ結(jié)合。結(jié)合后將使細胞內(nèi)的酪氨酸激酶激活，從而激活細胞內(nèi)信號傳導通路，促使細胞分裂分化以及組織器官的生長發(fā)育成熟。IGF-IR能夠發(fā)揮有絲分裂原作用，可以調(diào)控細胞分裂分化和增殖。對腦的發(fā)育以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復起到重要作用〔3～6〕。

本研究結(jié)果表明IGF-1R在小鼠耳蝸的成長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。隨著耳蝸發(fā)育的逐漸成熟其表達下調(diào)，調(diào)控能力下降。IGF-1R與IGF-I結(jié)合后，激活信號轉(zhuǎn)導通路。IGF-1R的表達與IGF-I密切相關。IGF-1可由體內(nèi)很多組織器官分泌，如肝臟分泌循環(huán)中IGF-1，生長激素/IGF-1軸(HG/IGF-1 Raxis)調(diào)節(jié)其表達〔7，8〕。IGFBP是一組和IGF-1R具有高度親和力的蛋白質(zhì)，已發(fā)現(xiàn)10種IGFBP，已成功克隆IGF-1R-6。IGFBP調(diào)節(jié)IGF-1R水平從而影響其生物效應。

IGF-1R與IGF-1結(jié)合后調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的全過程，維持調(diào)節(jié)神經(jīng)元的增生，分化及營養(yǎng)神經(jīng)功能。在神經(jīng)細胞培養(yǎng)方面的研究表明:在IGF-1培養(yǎng)液中生長的神經(jīng)細胞數(shù)量是正常培養(yǎng)的數(shù)十倍。在有神經(jīng)損傷的大鼠模型中研究表明:在損傷后第3天在受累腦組織區(qū)域IGF-1和IGF-1R mRNA的表達量明顯增加增加〔9，10〕。IGF-1R目前在腫瘤學及神經(jīng)損傷方面已進行研究，IGF-1R有望成為治療神經(jīng)損傷疾病的新靶點。但目前IGF-1R在耳聾保護的作用機制尚未完全清楚。

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The expression of IGF-1R in hair cells of normal developingm ice

CHEN Dong，HE Xin，GONG Liang，et al.
Ear Nose Throat Department，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121000，Liaoning，China

ObjectiveTo study the expression and distribution of IGF-1R of the inner ear in normal developingmice，and to elucidate the function and biological characteristics of IGF-1R.MethodsThe expression and distribution of IGF-1R of the inner ear during normal developing(P0-P20 after birth)micewas observed by fluorescence immunohistochemistry with laser scanning confocalmicroscope.IGF-1R protein andmRNA was examined byWestern blotand realtime PCR.ResultsIn the hair cell of cochlea，themRNA expressions of IGF-1R detected by in situ hybridization were almost the same as the protein expressions of IGF-1R tested with immunohistochemicalmethods.The IGF-1R was widely distributed in the cellmembrane of hair cells.The protein and mRNA expression of IGF-1R in hair cells and the quantity of expression decreased with aging.ThemRNA expression of IGF-1R in group P0 was higher than that in group P4，P12 and P20(P＜0.01)，and there was no significant difference between group P12 and group P20(P＞0.05).ConclusionsThere are expressions of IGF-1R in hair cells in normal developingmice.The expressions are related to ages and decrease with aging.IGF-1Rmay play an important role in signal transduction during inner ear cell proliferation in a paracrine and autocrinemanner.

Insulin-like growth factor receptor;Hair cells;Cochlea

R76

A

1005-9202(2013)12-2808-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2013.12.034

遼寧省教育廳高等學校科研項目(No.2009A460)

1 遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科 2 遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院兒科

陳 冬(1972-)，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉科相關疾病研究。

〔2012-11-19收稿 2013-02-27修回〕

(編輯 張海彬)