不同分子質量米糠多肽的抗氧化活性

張 敏，周 梅

(1.北京工商大學食品學院，北京 100037；2.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

自由基是單獨存在的具有不成對價電子的分子、原子、離子和基團。自由基包括氧自由基和非氧自由基，氧自由基占95%，如超氧陰離子自由基()、羥自由基(·OH)、過氧羥基自由基(HOO·)以及來自于脂質過氧化物的有機自由基(R·)和有機過氧自由基(ROO·)[1]。根據現有的研究報道，許多疾病如動脈粥樣硬化、中風、肝硬化、癌癥以及關節炎、白內障、人體衰老等過程都與自由基的作用有關[2]。因此保持機體自由基的產生與消除的平衡，防止自由基對細胞和組織的損傷，是預防各種疾病的有效措施之一。抗氧化物質是防病治病的關鍵物質，但一些人工的合成抗氧化劑，如叔丁基羥基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)等，能夠抑制人體的呼吸酶活性，使用過量甚至可致畸、致癌，有些國家已禁止使用[3]，因此研究天然、低毒、高效抗氧化劑的工作一直是食品和生物領域的重要課題。

我國是稻米生產大國，但是米糠的利用率很低，米糠中含有20%左右的蛋白質，米糠蛋白質中必需氨基酸的含量和相互比值也符合人體的需要，尤其適合于生長速度快以及胃消化功能尚不完全的嬰兒。且米糠蛋白質還具有低過敏性，可作為低敏性蛋白質原料用于嬰幼兒食品中[4]。

基于米糠蛋白的這一系列優點，近些年來，對米糠多肽的活性研究也成為了熱點。2007年，張強等[5]用胰蛋白酶制備的米糠抗氧化肽有很強的還原力，對·和·OH有很強的清除作用，且呈一定的量效關系。2008年，丁青芝等[6]用8種酶水解米糠蛋白制備降血壓肽，最終獲得ACE抑制率88.8%和水解度4.76%的降血壓肽。2009年，國外學者Chanput 等[7]用胃蛋白酶水解米糠獲得由6～30個氨基酸殘基組成的分子質量在670～3611D的抗氧化活性蛋白肽，最高活性組分主要為Tyr-Leu-Ala-Gly-Met-Asn；米糠抗氧化肽不僅對自由基具有較強的清除作用，而且無任何毒副作用。2010年，林敏剛等[8]用木瓜蛋白酶制備的米糠生物活性肽對·OH具有良好的清除能力。2010年，樊金娟等[9]對米糠抗氧化肽體外抗氧化作用進行研究，結果顯示，0.32mg/mL米糠抗氧化肽能夠抑制血紅蛋白氧化反應和紅細胞溶血，抑制率為50%左右。

現在測定抗氧化能力的方法很多，但還沒有一種方法可以完全地評價抗氧化物質的抗氧化能力，主要原因是由于生物體中有多個抗氧化系統，這些存在于體內的抗氧化系統的工作原理、相互之間的關系還沒有搞清楚，所以很難對抗氧化物質進行綜合評價；存在的多種自由基和抗氧化劑資源，它們各自都有不同的化學和物理特征。某一抗氧化劑可能在單一系統中同時有多重機制，或者在不同系統中表現出不同的機制。此外，對于不同的自由基，抗氧化劑的清除機制也不相同。現在采用的抗氧化評定方法大多為體外抗氧化測定，無法真實模擬生理環境，且各方法都僅測定了抗氧化能力中的某一方面，故無法模擬生理條件下的多條抗氧化途徑；測定的樣品大多為混合物質，其成分非常復雜，各抗氧化物質的抗氧化作用無法用單一的機制解釋[10-11]。因此，目前測定抗氧化物質的抗氧化能力常選用不同類型的測定指標。根據抗氧化物質的作用機理可將這些指標分為4類：1)活性氧自由基清除能力，包括·OH和·；2)基于氫原子轉移(HAT)的方法，包括氧自由基吸收能力(ORAC)、硫代巴比妥酸反應物法(TBARS)、硫酸氰鐵法(FTC)；3)基于電子轉移(SET)的方法，包括DPPH自由基清除能力、ABTS+·清除能力、FRAP(Fe3+還原能力)、總酚估計法；4)金屬離子螯合能力法。

本研究以米糠蛋白為原料，選用堿性蛋白酶酶解米糠蛋白制備米糠多肽，并對米糠多肽進行超濾，截留出分子質量大于10kD、3～10kD、小于3kD的米糠多肽產品，對其分別進行抗氧化活性的研究。在實驗中，根據抗氧化物的抗氧化機理不同選擇6種測定抗氧化能力的方法[12-13]，在不同的機制上表征米糠多肽的抗氧化活性體系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

米糠蛋白(蛋白含量71.51%、水分含量4.40%、灰分含量2.61%、碳水化合物15.64%、淀粉含量3.4%，脂肪含量＜1%) 黑龍江省北大荒米業有限公司。

Alcalase蛋白酶(235000U/g) 丹麥諾維信公司；DA2012-C大孔吸附樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團有限公司；ABTS+·清除能力檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

722型可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；K5600超微量分光光度計 北京凱奧科技發展有限公司；AKTAexplorer層析儀 德國GE Healthcare公司；超濾離心管 美國Milipore公司。

1.2 方法

1.2.1 米糠多肽的制備

米糠蛋白→配制底物質量濃度為5g/100mL的原料液→50℃恒溫水浴→酶解3h→滅酶(沸水浴5min)→12000r/min離心10min→取上清進行脫鹽處理(粗提液)→超濾(截留分子質量＞10kD、3～10kD、＜3kD)→抗氧化活性分析測定

1.2.2 大孔樹脂純化米糠多肽

將一定量的樹脂用無水乙醇浸泡24h，然后用無水乙醇洗至220nm無吸收峰時，再用去離子水洗凈后備用。稱取100g濕樹脂于250mL錐形瓶中，加100mL米糠多肽，25℃恒溫搖床150r/min，使其充分吸附后棄去未吸附的鹽溶液，用75%乙醇依次洗脫，分別收集洗脫液并濃縮得到初步的純化，脫除大部分鹽和糖的米糠多肽產品。

將不同分子質量的米糠多肽配制成質量濃度為0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6mg/mL進行實驗。

1.2.3 水解液中含氮量(以蛋白質含量計)

采用福林-酚法[14]測定多肽含量，以牛血清蛋白為標樣，回歸方程為：Y=904.93x+0.9162(R2=0.9991)，式中，Y為蛋白質量濃度/(μg/mL)；x為吸光度。

1.2.4 ·OH清除能力的測定[15]

利用Fenton反應產生的·OH與甲基紫作用前后測定244nm波長吸光度的變化來計算清除率。5mL甲基紫溶液吸光度為A；混合液吸光度為A0；樣品反應后吸光度為AS。清除率按式(1)進行計算。

采用鄰苯三酚自氧化法略有改動[13]，加入各種試樣，在420nm波長處測吸光度。清除率按式(2)進行計算。

式中：A空白為pH 8.2Tris-HCl 6mL＋1mL 7mmol/L PR＋8mol/L HCl兩滴，用蒸餾水定容至10mL；A樣品為pH8.2 Tris-HCl 6mL＋2mL樣品＋1mL7mmol/L PR＋8mol/L HCl兩滴，用蒸餾水定容至10mL；A本底為pH8.2 Tris-HCl 6mL＋2mL樣品＋8mol/L HCl兩滴，用蒸餾水定容至10mL。

1.2.6 DPPH自由基清除能力的測定

按照參考文獻[16]，黑暗室溫條件下放置30min后在517nm波長處測吸光度，清除率按式(3)計算。

式中：A0為1.5mL DPPH+1.5mL乙醇；A1為1.5mL DPPH+1.5mL樣品水解液；A2為1.5mL乙醇+1.5mL樣品水解液。

1.2.7 Fe3+還原能力的測定[17]

在試管中分別加入不同質量濃度樣品、磷酸鹽緩沖溶液和鐵氰化鉀，水浴后加入三氯乙酸、蒸餾水和三氯化鐵溶液。樣品在700nm波長處測定吸光度。反應物的吸光度增加表明還原力增強。

1.2.8 ABTS+·清除能力的測定

采用試劑盒在414nm波長處測定ABTS+·的吸光度即可計算出樣品的總抗氧化能力。以Trolox為標樣，標準曲線方程為：Y= 1.6166－1.6824x(R2=0.9974)，式中，Y為標準品Trolox的濃度/(mmol/L)；x為吸光度。

1.2.9 Fe3+螯合能力的測定

采用磺基水楊酸顯色法[18]。螯合能力按式(4)計算。

式中：X為每克樣品螯合Fe3+能力/(mg/g)；V為樣品消耗硫酸鐵銨溶液的體積/mL；c為硫酸鐵銨溶液的濃度/(mol/L)；m為樣品質量/g。

2 結果與分析

2.1 米糠蛋白和米糠多肽對·OH的清除作用

圖1 米糠蛋白和米糠多肽對·OH清除能力Fig.1 Hydroxyl radical scavenging activity of rice bran protein and rice bran polypeptides

由圖1可知，不同質量濃度不同分子質量的米糠多肽對Fenton試劑系產生的·OH均具有清除作用，隨著質量濃度的提高不同分子質量的米糠多肽對·OH的清除率也隨之提高；質量濃度在0.3～1.2mg/mL時Mw＞10kD的米糠多肽的清除率最高為35.94%，質量濃度在2.4～4.8mg/mL時Mw為3～10kD的米糠多肽的清除率最高為47.18%，質量濃度在9.6mg/mL時Mw＞10kD的米糠多肽的清除率最高為53.38%，Mw為3～10kD和Mw＜3kD的米糠多肽的清除率也達到最高分別為48.67%和45.85%；米糠蛋白對·OH的最大清除率為15.47%，明顯低于米糠多肽的·OH清除率；在不同分子質量的米糠多肽中，隨著分子質量的增加，米糠多肽的清除率增加，只有在2.4～4.8mg/mL時Mw為3～10kD的米糠多肽表現出較強的清除率，質量濃度＜2.4mg/mL以后此分子質量的的米糠多肽，清除率的增加不顯著。由圖1、2對比可知，質量濃度9.6mg/mL的Mw＞10kD的米糠多肽相當于質量濃度0.06mg/mL的VC和BHT對·OH的清除能力。

圖2 VC和BHT對·OH的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging activity of vitamin C and BHT

由Fenton反應所生成的·OH能使氨基酸發生氧化修飾，即構成蛋白質的多肽和氨基酸能捕捉活性氧，隨之發生自由基連鎖反應的終止[19]，這種性質意味著Mw＞10kD的米糠多肽屬于清除自由基捕捉型的氧化劑，在活性氧、自由基的防御系統中起到阻斷連鎖反應的作用，屬于活性氧自由基清除能力的作用機制。

2.2 米糠蛋白和米糠多肽對·的清除作用

圖3 米糠蛋白和米糠多肽對·的清除能力Fig.3 Superoxide anion radical scavenging activity of rice bran protein and rice bran polypeptides

圖4 VC和BHT對·的清除能力Fig.4 Superoxide anion radical scavenging activity of vitamin C and BHT

2.3 米糠蛋白和米糠多肽對DPPH自由基的清除作用

圖5 米糠蛋白和米糠多肽對DPPH自由基的清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging activity of rice bran protein and rice bran polypeptides

圖6 VC和BHT對DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of vitamin C and BHT

由圖5可知，米糠多肽較低質量濃度下就對DPPH自由基具有清除能力，質量濃度的增加對清除效果的變化不顯著；隨著不同分子質量的米糠多肽質量濃度的增加，清除率逐漸增高；隨著分子質量的增加清除率呈下降的趨勢，Mw＜3kD的米糠多肽在高質量濃度下DPPH自由基清除率最大為82.07%。不同質量濃度不同分子質量的米糠多肽對DPPH自由基清除率影響很大，可能與特定時間水解產生的活性片段的多少、長度和序列等有關[20]。米糠蛋白的DPPH自由基清除率隨質量濃度變化不大，最大值只有29.91%，進一步證實DPPH自由基清除率可能與特定時間水解產生的活性片段的多少、長度和序列等有關的這一說法。由圖5、6對比可知，質量濃度9.6mg/mL的Mw＜3kD的米糠多肽相當于質量濃度0.1mg/mL以上的VC和0.04mg/mL BHT對DPPH自由基的清除能力。

Mw＜3kD的米糠多肽對DPPH自由基的清除能力最強，可能由于空間位阻決定反應的傾向，小分子化合物由于更易接近自由基而擁有相對較高的抗氧化能力[21]。

2.4 Fe3+還原能力

圖7 VC對Fe3+還原能力Fig.7 Fe3+ reducing capacity of vitamin C

圖8 米糠蛋白和米糠多肽對Fe3+還原能力Fig.8 Fe3+ reducing capacity of rice bran protein and rice bran polypeptides

圖7 ～8給出了VC、米糠蛋白和不同分子質量的米糠多肽的Fe3+還原能力，由于BHT在Fe3+還原體系反應中會出現混濁，所以不做陽性對比。可以看出，隨著反應質量濃度的增加，對Fe3+的還原能力也在增加，呈現一定的正相關關系。隨著米糠多肽分子質量的增加，對Fe3+還原能力亦呈下降的趨勢。在最高質量濃度條件下，Mw＜3kD的米糠多肽對Fe3+還原能力最高(A700nm=0.544)，其次是Mw為3～10kD的米糠多肽對Fe3+還原能力(A700nm=0.417)，再次是Mw＞10kD的米糠多肽對Fe3+還原能力(A700nm=0.365)。米糠蛋白在不同質量濃度下對Fe3+還原能力的影響變化不大，在9.6mg/mL質量濃度時具有最大還原力(A700nm=0.189)。圖7和圖8對比可知，質量濃度9.6mg/mL的Mw＜3kD的米糠多肽相當于質量濃度0.1mg/mL以上的VC對Fe3+還原能力。

抗氧化劑的還原力與其抗氧化性之間存在聯系。抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基的，還原力越強，抗氧化性越強[22]。Mw＜3kD的米糠多肽具有較強的電子轉移能力。

2.5 ABTS+·清除能力

ABTS+·是抗氧化評價實驗常用自由基[23-24]。在研究抗氧化藥劑作用時用以評估藥劑捕捉自由基能力，而作為藥劑抗氧化能力的評價基準。不同分子質量的米糠多肽對ABTS+·的清除率能力見圖9。不同分子質量的米糠多肽質量濃度在0.3～0.6mg/mL時，對ABTS+·的清除能力較弱；隨著不同分子質量的米糠多肽質量濃度增加，清除率上升幅度較大；當不同分子質量的米糠多肽質量濃度為9.6mg/mL時，對ABTS+·清除率達到最大；米糠多肽的分子質量越大，清除能力越弱。在最高質量濃度條件下，Mw＜3kD的米糠多肽對ABTS+·清除率最大為0.838mmol/L Trolox。米糠蛋白對ABTS+·清除率最大只達到0.367mmol/L Trolox，經過堿性蛋白酶酶解米糠蛋白制備的米糠多肽對ABTS+·清除率有很大提高。

圖9 米糠蛋白和米糠多肽對ABTS+·清除能力Fig.9 ABTS+· scavenging activity of rice bran protein and rice bran polypeptides

2.6 Fe3+螯合能力

過渡金屬如鐵、銅等可以誘導多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應而損害生物膜，產生毒性過氧化產物。Fe3+螯合能力與抗氧化性能有著密切的關系。由圖10可知，米糠蛋白和不同分子質量的米糠多肽對Fe3+具有明顯的螯合能力；不同分子質量的米糠多肽質量濃度在0.3～4.8mg/mL時對Fe3+螯合能力變化并不明顯，質量濃度在9.6mg/mL時對Fe3+螯合能力較強；米糠蛋白對Fe3+螯合能力同Mw＜3kD的米糠多肽對Fe3+螯合能力相當，對Fe3+螯合能力最大的是Mw為3～10kD的米糠多肽。質量濃度9.6mg/mL時Mw為3～10kD的米糠多肽對Fe3+螯合能力最大達到0.878mg/g，相當于0.75mg/mL左右的VC和BHT對Fe3+螯合能力的量。

多羧基有機化合物具有較強金屬螯合能力[23]。米糠多肽對Fe3+的螯合能力可能與其中含有多羥基酚酸類化合物有關。中等分子質量的米糠多肽主要產生多羥基酚酸類化合物以螯合金屬離子，屬于金屬離子螯合能力的抗氧化機制。

圖10 米糠蛋白和米糠多肽對Fe3+螯合能力Fig.10 Fe3+-chelating capacity of rice bran protein and rice bran polypeptides

3 結 論

本研究將米糠多肽超濾后分別獲得Mw＞10kD、Mw3～10kD、Mw＜3kD不同分子質量的米糠多肽混合物組分，將它們與米糠蛋白、VC和BHT的抗氧化能力進行對比，研究結果說明，米糠多肽的抗氧化活性與蛋白分子質量大小、質量濃度等密切相關。

隨著不同分子質量的米糠多肽的質量濃度增加，抗氧化活性都有相應程度的增加。高分子質量的米糠多肽(Mw＞10kD)在高質量濃度(9.6mg/mL)的條件下對·OH的清除能力最強，屬于具有活性氧自由基清除能力的抗氧化機制。Mw＜3kD的米糠多肽在高質量濃度(9.6mg/mL)的條件下對·的清除能力、DPPH自由基的清除能力、ABTS+·清除率、Fe3+還原能力最大，屬于電子轉移(SET)的抗氧化機制。質量濃度在9.6mg/mL時Mw為3～10kD的米糠多肽對Fe3+螯合能力最強，屬于金屬離子螯合能力的抗氧化機制。

在米糠活性肽應用過程中，應根據實際情況，選擇具有最佳效果的相應質量濃度及分子量肽段的米糠蛋白產品。

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