色譜法檢測動物源食品中喹諾酮類藥物殘留研究進展

李佩佩，郭遠明，陳雪昌*，張小軍，梅光明，龍 舉

(浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江 舟山 316100)

色譜法檢測動物源食品中喹諾酮類藥物殘留研究進展

李佩佩，郭遠明，陳雪昌*，張小軍，梅光明，龍 舉

(浙江省海洋水產研究所，浙江省海水增養殖重點實驗室，浙江 舟山 316100)

喹諾酮類藥物是一類廣譜高效抗菌藥物，廣泛應用于畜禽和水產養殖。喹諾酮類藥物在動物源食品中的殘留會對人體健康造成危害。目前動物組織中喹諾酮類藥物殘留檢測方法有很多，其中高效液相色譜(HPLC)和高效液相串聯質譜法(HPLC-MS-MS)是主要方法。色譜法檢測喹諾酮類藥物的一般步驟為樣品提取、凈化、濃縮，進HPLC柱或HPLC-MS-MS柱定量檢測。本文對色譜法檢測動物源食品中喹諾酮類藥物殘留研究做簡要綜述，以期為食品中喹諾酮類的多殘留檢測提供一定的參考。

喹諾酮類；殘留；檢測；動物源食品；高效液相色譜；質譜

喹諾酮類(quinolones，QNs)是一大類具有1,4-二氫-4-氧代喹啉-3-羧酸結構的人工合成抗菌藥物，對革蘭氏陰性菌和陽性菌有抑制作用，因具有高效低毒、抗菌譜廣、價格低廉、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等優點而廣泛用于臨床診療、動物疾病預防及促生長[1]。QNs在動物源食品中的過量或不當使用會引起食用者產生潛在“三致”(致癌、致畸、致突變)作用，誘導致病菌產生耐藥性，從而威脅人類健康[2]，因此許多國家和組織都限制其使用并制訂出相應的最高殘留限量(MRLs)：歐盟規定動物肌肉、肝臟和腎臟中達氟沙星、二氟沙星、恩諾沙星(環丙沙星與恩諾沙星量之和)、麻保沙星、沙拉沙星等的MRLs為0.01～1.9mg/kg；美國禁止在食用動物養殖中使用FQNs；我國于2002年規定了環丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸和氟甲喹等7種QNs藥物在動物肌肉組織中的最高殘留限量為10～500μg/kg。

QNs的多殘留分析是當今研究的熱點。Carlucci[3]綜述了1998年以前關于QNs殘留研究的近250篇文獻，Hernández-Arteseros等[4]總結了2001年以前的100多篇文獻，Andreu等[5]總結比較了2002—2006年食品和環境中QNs類殘留的前處理和測定方法。國內最早的報道為1994年邱銀生等[6]對豬和雞的肝、腎和肌肉中的煙酸諾氟沙星殘留研究。目前QNs的檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[7]、高效液相-串聯質譜法(HPLC-MS-MS)[8-9]、酶聯免疫法(ELISA)[10]、微生物法[11-12]、高效毛細管電泳分析法[13-14]等。酶聯免疫法可能造成樣品假陽性，不適合作殘留確證，適用于大量樣品的快速篩選；微生物法檢測限過高，特異性不強；高效毛細管電泳分析法的檢測限也較高；HPLC法特異性強、定量準確，缺點是測定種類少、不能作定性分析、檢出限難以進一步降低；HPLCMS-MS法靈敏度高、檢測限低、測定種類多、集高效分離和結構鑒定于一體，該儀器在我國檢測機構中的配置也較為普遍，已成為復雜混合物中痕量組分定性和定量的有力工具，國家標準中近一半方法為液質方法。色譜法檢測QNs殘留包括樣品前處理和色譜測定2大步驟，本文從這兩方面總結動物源食品中QNs殘留的色譜測定有關內容。

1 樣品提取

1.1 提取溶劑

QNs為極性化合物，易溶于極性和水溶性有機溶劑、稀酸和堿溶液，不溶于非極性溶劑。動物源食品中QNs的提取劑大致可歸納為4種[15-16]：1)水不溶性有機溶劑，如二氯甲烷和三氯甲烷；2)強極性有機溶劑，如乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯；3)水溶性有機溶劑和酸、堿的混合液，如鹽酸/磷酸/乙酸/三氯乙酸/氨水-乙腈、乙酸/三氯乙酸-甲醇等；4)緩沖溶液，如磷酸和檸檬酸緩沖溶液等。

早期QNs殘留提取常用乙酸乙脂、二氯甲烷、三氯甲烷[17-19]。由于乙酸乙脂和二氯甲烷對人體和環境有較大危害，釋放藥物能力差，現已不常用。目前酸性喹諾酮大多用堿性溶液提取，含哌嗪基的喹諾酮(PQs)一般用pH值接近于7的溶液提取，如劉麗貞等[20]用丙酮和0.1mol/L氫氧化鈉體積比為10:1來提取魚肉中的諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星殘留。

直接提取試劑首選乙腈，其溶解強度大、黏度系數低，可有效沉淀蛋白。甲醇、丙酮因蛋白沉淀效果差、提取液雜質含量高而不常用。生物樣品大多含有一定水分，有機溶劑提取時一般加入無水Na2SO4來促進鹽析和提高回收率。乙腈、甲醇中混入少量的磷酸、鹽酸、乙酸、三氯乙酸、氫氧化鈉、氨水等對QNs具有良好的組織滲透性、脫蛋白質和釋放藥物作用，可大幅度提高回收率，是QNs殘留分析常用的提取方法。用酸化乙腈提取時一般也加入5～30g的無水Na2SO4(以5g樣品計)。Bailac等[21]曾比較了二氯甲烷和酸化乙腈V(0.3%磷酸):V(乙腈)=25:75 2種提取劑對雞肉中QNs的提取效果，發現雖然使用二氯甲烷提取的樣品雜質少，但使用酸化乙腈提取的樣品分析時間短，檢出限低。有機溶劑中添加酸或堿的濃度、種類和比例對樣品提取效率均有較大影響。施冰等[22]分析魚肉等組織時研究了乙腈和0.1%甲酸的比例對去除蛋白效果的影響：當乙腈含量低于50%時，蛋白質不易沉淀，提取液離心無法澄清；乙腈含量提高，去除蛋白的能力增強；乙腈和0.1%甲酸體積比為80:20時的提取效果好于乙腈和冰乙酸體積比為100:1時。劉莉莉[23]考察了不同配比的磷酸-乙腈對草魚體內蛋白去除和QNs提取效果的影響，最終確定磷酸和乙腈體積比為25:75時為最佳條件。Posyniak等[24]研究了不同比例的乙腈-三氯乙酸(TCA)對雞肉中恩諾沙星、環丙沙星、二氟沙星、沙拉沙星4種藥物的提取效率，研究表明5% TCA和乙腈的比例為8:2或7:3時，4種QNs的回收率最高(高于80%)，9:1時最低(低于75%)；保持TCA和乙腈的比例為8:2不變，研究了不同濃度的TCA溶液對脫蛋白的效果，最后確定10% TCA和乙腈比例為8:2時，具有最好的回收率和脫蛋白效果。

很多研究者也使用緩沖溶液作為提取劑。如董琳琳等[25]用不同pH值的磷酸二氫鉀緩沖溶液勻漿提取了雞的肌肉、皮脂、肝和腎4種組織中的4種QNs殘留；趙思俊等[26]用pH7.0的0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液提取雞肉和豬肉中的7種QNs殘留；劉媛[27]、林玲[28]等分別用pH7.0的磷酸鹽緩沖液提取了禽蛋中的QNs殘留。

1.2 提取量和提取方式

提取時一般取1～5g樣品，每1g樣品約需用5～10mL的提取液，多次重復提取。提取過程采用高速勻質、機械振蕩或超聲。Hermo等[29]引進微波輔助提取(MAE)技術提取豬肉中的QNs，提取后的樣品比常規方法含有的干擾物質更少，且快速簡單，適用于分析大量樣品。

2 樣品凈化

目前QNs的凈化方法主要為液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)，具體實驗中需依據樣品基質和提取溶劑選擇適宜的凈化方法。

LLE是凈化QNs的基本方法。調節pH值使QNs在兩相間分配，或利用不互溶的溶劑對雜質和待測組分溶解性的差別進行分配。乙腈作為提取劑時一般用極性較小的正己烷除脂。由于乙腈和正己烷有一定的互溶性而影響回收率，有時也用乙腈飽和的正己烷[30]。為達到更好的除雜效果，研究者在提取液旋蒸干用乙腈溶解后再在離心管中加1～2mL的正己烷通過漩渦混合進行小體積的液-液分配[31]。LLE由于存在操作費時、消耗高純溶劑多以及樣品易乳化等不足已逐步被SPE代替。

SPE消耗溶劑少、不產生乳化現象，是凈化QNs最常用的方法，約占QNs凈化方法的70%，主要用于極性溶劑和緩沖溶液提取QNs之后。QNs常用的SPE柱主要為硅膠鍵合C18或C8的反相柱和硅膠鍵合苯磺酸基或丙酸基等基團的離子交換柱(如SCX、PRS、MPC)，聚合物基質的SPE柱使得SPE技術應用更為廣泛，如 HLB柱和ENV柱[32]。Bailac等[33]比較了Oasis HLB、Oasis MAX 和SDB-RPS 3種SPE柱對雞肉樣品的凈化效果，實驗表明經Oasis MAX柱凈化的樣品中環丙沙星的回收率低于25%，經HLB 柱凈化后的樣品譜圖中達氟沙星目標峰處有雜質干擾，因此在這3種柱回收率都較高的情況下選擇了SDB-RPS柱作為凈化柱。趙思俊[16]將制備的免疫親和柱應用在13種QNs的凈化上并取得了較好的效果。對于同一種SPE柱，上樣液和淋洗液的體積以及洗脫液的強度對回收率均有影響；不同品牌的同種SPE柱對回收率也有影響[25]。反相柱的淋洗液通常使用水、含有較低濃度有機溶劑(如甲醇、乙腈)或弱酸性的水溶液，洗脫液常用純甲醇(或乙腈)以及甲醇(或乙腈)比例大于75%以上的酸或堿性溶液。離子交換柱的淋洗液一般使用緩沖溶液，洗脫液常用含有高濃度有機溶劑的酸或堿性溶液，如甲醇-NH3·OH[34]、乙腈-2%～4%的三氟乙酸水溶液[32-33]。對于雜質含量較多的動物組織，有研究者還采用兩步SPE凈化或者先正己烷除脂再SPE凈化的方法[35]。SPE方法的缺點是SPE柱價格相對昂貴、結果重現性差、目標化合物的回收率和精密度比LLE低[36]。

目前，基質固相分散萃取、超臨界流體萃取、固相微萃取、加速溶劑萃取和分子印跡固相萃取等較新的方法也應用到QNs殘留分析中。基質固相分散技術適用于萃取對固體、半固體和高黏稠的生物樣品中的分析物。如喬鳳霞等[37]采用基質固相分散-HPLC法分析了牛奶、蜂蜜中的多種QNs。蜂蜜的檢出限為0.125μg/kg；申京宇等[38]等利用超臨界流體萃取-HPLC法檢測了雞肉中的4種QNs。

3 樣品濃縮

樣品凈化后的濃縮方法通常為真空旋轉蒸發和氮氣水浴吹干。當樣品量大于10mL時前者比較簡便快速。旋蒸過程中易產生爆沸、蒸干后溶解不充分會導致回收率比氮吹低。劉莉莉[23]比較了旋蒸溫度為45、50、55℃對回收率的影響，發現溫度對回收率變化的影響不大。

4 HPLC法檢測

4.1 色譜柱的選擇

QNs的叔胺基和羧基官能團在水中解離會導致色譜柱填料表面殘留的硅醇基(硅羥基)和金屬雜質通過氫鍵或離子交換作用強烈吸附QNs，造成色譜峰拖尾、峰形異常和分離度下降等現象，因此QNs殘留分析多采用以高純硅膠為基質并經端基封閉處理的色譜柱，如C18、C8柱、苯基柱。非硅膠基質的聚合物柱也有應用。一般柱的規格為(250mm×4.6mm，5μm)；UPLC的柱填料粒徑小于2μm。

4.2 流動相的選擇

流動相一般由有機試劑、酸性溶液、離子對試劑(如三乙胺或四丁基溴化銨)三部分組成。QNs藥物具有可質子化的氮原子和離解的羥基，經反相色譜柱測定時會出現峰拖尾現象，加入離子對試劑可改善QNs的峰形和提高分離度。有研究發現三乙胺作為離子對試劑不能有效地分離氧氟沙星和諾氟沙星[39]。流動相的pH值對QNs的分離和保留也有顯著影響：QNs是酸堿兩性化合物，其解離狀態和在流動相中的溶解性隨pH值變化；硅膠鍵合固定相表面殘余硅醇基的解離程度與流動相pH值也有關[40]，pH＞3即完全解離。而當pH值過低(＜2.0)時個別QNs不能有效分離[16]，在流動相比例不變的情況下，過低的pH值會導致QNs的保留時間延長，且低酸度也會影響色譜系統壽命，因此流動相的pH值一般調節為2.0～3.0。我國農業部標準[41]中測定3種QNs采用的流動相為乙腈和四丁基溴化銨溶液(磷酸調pH值為3.0)體積比為5:95，很多文獻中也使用此流動相。此外，乙腈-磷酸(三乙胺調節pH值)也有應用。磷酸鹽、檸檬酸鹽與乙腈混合時易產生結晶而引起色譜管路堵塞，且靈敏度也較低，故研究者對流動相做了改進：以甲酸或乙酸來代替緩沖鹽，如趙思俊等[26]用0.1%甲酸-甲醇作為流動相檢測動物肌肉組織中7種QNs；乙腈-甲醇-水(或弱酸)作為流動相也可使分離更快速和靈敏[20]，如V(乙腈):V(甲醇):V(0.1%三氟乙酸)＝20:8:72。當測定的QNs種類較多時，采用梯度條件洗脫、程序波長熒光檢測器檢測可提高分離效果和靈敏度。

4.3 流速和柱溫

流速和柱溫對保留時間和峰型都有影響。增大流速和升高柱溫會縮短保留時間，使峰型更加尖銳，但流速太大、柱溫太高會損害色譜柱，造成峰重疊，因此需要根據具體實驗情況確定合適的流速和柱溫。柱溫一般選擇30～40℃，流速為0.8～1.0mL/min。

4.4 檢測器的選擇

QNs具有較強的紫外吸收和熒光性質，動物組織中QNs殘留既可用紫外也可用熒光檢測器檢測。

4.4.1 紫外檢測(UV)

UV應用不多，檢測波長通常為254～280nm，主要用于檢測體液和飼料中的QNs。陳輝華等[42]用UV同時測定了魚肉中的5種FQs(沙拉沙星、恩諾沙星、達氟沙星、環丙沙星、單氟沙星)。二極管陣列檢測器(DAD)也有應用，孟勇等[40]應用反相高效液相色譜法配二極管陣列檢測器在波長279nm處測定了中華絨螯蟹肝臟中諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星的殘留量。Cinquina等[43]分析了羊奶中的恩諾沙星及其代謝物環丙沙星，奶樣用磷酸鹽緩沖液提取，C18SPE柱純化，在277nm波長處用HPLCDAD分析，定量檢出限為20μg/kg。

4.4.2 熒光檢測

熒光檢測器較UV靈敏度高2～3個數量級，因此絕大多數QNs殘留分析使用熒光檢測器。QNs分子結構復雜、熒光特性各異。含有哌嗪環的QNs(絕大部分的FQs，如諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星、二氟沙星等)和不含哌嗪環的QNs(如噁喹酸、氟甲喹等)具有不同的熒光光譜特性，前者激發波長(λEx)一般采用285、280、278、297nm，對應的發射波長(λEm)為460、450、446～465、515nm；后者(λEx)為320nm，(λEm)為365nm。使用熒光檢測法進行QNs多殘留檢測時采用程序波長檢測法可提高檢測靈敏度和選擇性。

4.5 檢測限

近幾年來分析較多的動物源食品是肌肉組織，其次是肝、腎、皮膚、脂肪。由于檢測的靶組織、QNs種類以及樣品前處理和檢測條件不同，動物源食品中QNs殘留的檢測限也各有不同。目前水產品中HPLC法檢測QNs的檢出限一般為0.2～10μg/kg。檢測限較低的研究有：Schneider等[44]等用HPLC-FLU法測定了雞肉中的多種QNs殘留，其中達氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星、二氟沙星、沙拉沙星的檢測限分別為0.5、1.0、2.0、5.0μg/kg。劉慧慧等[45]對魚肉中恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星和二氟沙星進行了檢測，其檢測限分別是1.0、0.3、0.2、0.2μg/kg。趙思俊等[26]對雞肉和豬肉中環丙沙星、單諾沙星等7種QNs進行了檢測，檢出限為0.1～0.3μg/kg，定量限為0.3～1.0μg/kg。劉波靜[46]分析了雞肉、脂肪、雞肝和雞腎中的氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星，檢測限均為0.92μg/kg。李娟[15]同時檢測了牛肉、豬肉、豬肝和豬腎4種組織中的QNs殘留，最低檢測限和定量限在牛肉中分別為0.2～6.5μg/kg和0.7～21.6μg/kg，在豬肉中為0.2～6.0μg/kg和0.8～20.0μg/kg，在豬肝中為0.3～10.0μg/kg和1.2～33.3μg/kg，在豬腎中為0.3～8.2μg/kg和0.9～27.2μg/kg。

5 HPLC-MS-MS檢測

目前約60%的QNs檢測使用HPLC-MS-MS。Hermo等[32]研究發現使用MS測定的QNs檢出限比LC-UV低35倍。李雅麗等[47]等研究發現MS的檢測靈敏度比熒光檢測器高5～10倍。由于采用MS分析，不能使用難于氣化的磷酸鹽等緩沖液流動相體系，因此HPLC-MS-MS的流動相多為0.1%的甲酸(或三氟乙酸或乙酸銨)溶液-乙腈(或甲醇、0.1%甲酸乙腈、0.1%甲酸甲醇)。因測定藥物種類多，為達到不同藥物的最佳檢測條件，流動相均采用梯度洗脫程序。一般使用電噴霧離子源(ESI)和多反應監測模式(MRM)。Toussaint等[48]用LC-MS-MS對豬腎臟中的11種QNs同時定量和確證，檢測限均小于或等于50μg/kg；Bailac等[21]檢測了雞肉中的7種QNs，檢測限為0.15～0.5μg/kg；Johnston等[49]用LC-MS-MS同時分析了鮭魚、對蝦和鮑魚中的8種喹諾酮和氟喹諾類藥物的殘留量，所有分析樣品在12min內出峰，檢測限為1～3μg/kg；岳振峰等[50]測定了雞肉、雞肝、魚肉中的16種QNs，所有藥物在9min內全部出峰，測定低限均為10μg/kg。李雅麗等[47]等建立了雞和魚肌肉組織中19種QNs的HPLC-ESIMS-MS檢測法，檢出限為0.3μg/kg。田媛等[51]等用內標法測定了雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留，定量限為1μg/kg。黃優生等[52]建立了快速測定魚肉中4種氟喹諾酮類藥物殘留的HPLC-MS法，檢出限為0.1～0.4μg/kg，定量限為0.3～1.0μg/kg。魏伯平等[53]采用RP-HPLC-MS-MS法同時測定了雞肉中7種QNs，檢測限為0.25～1.07μg/kg。施冰等[22]建立了鰻魚、蝦、魚肉中7種氟喹諾酮類藥殘的LC-ESI-MS-MS定量檢測和確證方法，定量限為1.8～9.6μg/kg。HPLC-MS-MS法還可實現包括QNs類藥物在內的多種藥物的同時測定。如李峰格等[54]利用分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜技術測定了雞肝中12種磺胺類、19種喹諾酮類和8種苯并咪唑類藥物及其代謝物殘留，39種藥物的檢出限均為5μg/kg。

6 結 語

HPLC和HPLC-MS-MS法是測定QNs的主要方法，在具體實驗中需根據所測靶動物和QNs的種類以及檢測要求選擇適宜的前處理和色譜條件。未來HPLC-MS-MS法的發展方向是在定量檢測藥物的同時能提供物質的結構信息以及對未知藥物給予確證。

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Chromatographic Detection of Quinolones Residues in Animal Tissues

LI Pei-pei，GUO Yuan-ming，CHEN Xue-chang*，ZHANG Xiao-jun，MEI Guang-ming，LONG Ju
(Zhejiang Province Key Laboratory of Mariculture and Enhancement, Marine Fishery Research Institute of Zhejiang, Zhoushan 316100, China)

Quinolones is a kind of antibacterial agents with broad-spectrum antibacterial capability. It is widely applied in animal and aquaculture. The residues of quinolones in animal-derived foods can be dangerous for human health. HPLC (high performance liquid chromatography) and HPLC-MS-MS are major methods to analyze quinolones residues. The general steps of HPLC and HPLC-MS-MS for quinolones detection including sample extraction, purification, condensation and final quantitative detection have been reviewed in this paper.

quinolones；residues；detection；animal-derived food；HPLC；MS

TS207.3；O657

A

1002-6630(2013)03-0303-05

2012-01-05

浙江省重點科技創新團隊項目(2010R50028)；浙江省科技計劃項目(20120F30021)

李佩佩(1986—)，女，碩士，研究方向為水產品藥物殘留檢測。E-mail：liwanzhao999@163.com

*通信作者：陳雪昌(1970—)，男，高級工程師，碩士，研究方向為水產品質量安全。E-mail：13567679178@163.com